SFRP5在胰腺癌中的表达意义及其shRNA慢病毒载体的构建

发布时间：2017-08-24 04:12

  本文关键词：SFRP5在胰腺癌中的表达意义及其shRNA慢病毒载体的构建

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【摘要】：目的:探讨SFRP5基因在胰腺癌组织中的表达情况及其与临床病理因素和预后的关系,设计和构建人SFRP5-sh RNA慢病毒载体,并进行鉴定和包装,为下一步探索SFRP5在胰腺癌细胞系中的作用机理提供实验材料。方法:收集兰州大学第一医院普外科2010年至2013年间的胰腺癌石蜡包埋切块。选择病理诊断明确、病理和随访资料完整的71例标本,采用免疫组化方法,检测SFRP5在胰腺癌及癌旁组织中的表达情况,并分析SFRP5的表达情况与临床病理因素及患者预后的关系;利用Western-bloting和q RT-PCR方法,提取新鲜组织中的蛋白和m RNA,检测SFRP5蛋白和SFRP5 m RNA在胰腺癌新鲜组织中的表达情况。根据Gen Bank上公布的人SFRP5基因信息,构建SFRP-sh RNA慢病毒干扰载体,通过293T细胞进行慢病毒包装,并测定病毒滴度。结果:SFRP5蛋白在胰腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织(40.8%vs85.7%,P0.05),SFRP5蛋白表达与胰腺癌患者的TNM分期(P0.05)、远处转移(P0.05)、胰周侵犯(P0.05)及预后具有相关性,并且是胰腺癌患者预后的独立影响因素。成功构建SFRP5-sh RNA慢病毒载体,转染293T细胞后在荧光显微镜下可见绿色荧光,并进行病毒包装,纯化出慢病毒颗粒,测得其滴度1*109 TU/ml。结论:SFRP5蛋白在胰腺癌中表达消失,是影响胰腺癌患者预后的独立影响因素,SFRP5低表达、存在远处转移、TNM分期晚及存在胰周侵犯的患者预后较差。通过RNA干扰技术,成功构建人SFRP5-sh RNA慢病毒载体,包装后获得较高的病毒滴度,其感染的胰腺癌细胞系将为后续的胰腺癌细胞生物学研究提供实验基础。
【关键词】：SFRP5 胰腺癌 慢病毒
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-5
• 中英文对照表5-8
• 前言8-11
• 第一部分 SFRP5在胰腺癌中的表达意义11-34
• 1.1 实验材料11-13
• 1.1.1 组织标本11-12
• 1.1.2 实验试剂及耗材12
• 1.1.3 主要仪器12-13
• 1.2 实验方法13-20
• 1.2.1 主要试剂的配制13-14
• 1.2.2 Western-Blot法检测胰腺癌及癌旁组织中SFRP5蛋白的表达14-16
• 1.2.3 q RT-PCR法检测胰腺癌及癌旁组织中SFRP5 m RNA的表达16-18
• 1.2.4 免疫组织化学法检测胰腺癌组织中SFRP5蛋白的表达18-19
• 1.2.5 统计学方法19-20
• 1.3 结果20-30
• 1.3.1 胰腺癌及癌旁组织中SFRP5蛋白的表达20-21
• 1.3.2 胰腺癌及癌旁组织中SFRP5 m RNA的表达21
• 1.3.3 免疫组化分析结果21-23
• 1.3.4 SFRP5蛋白表达与临床病理因素之间的关系23-24
• 1.3.5 SFRP5蛋白表达与胰腺癌预后的关系24-30
• 1.4 讨论30-33
• 1.5 小结33-34
• 第二部分 SFRP5-sh RNA慢病毒载体的构建34-47
• 2.1 实验材料34-35
• 2.1.1 慢病毒载体信息34-35
• 2.1.2 试剂35
• 2.1.3 仪器35
• 2.2 实验方法35-40
• 2.2.1 sh RNA靶点的选择35-36
• 2.2.2 sh RNA引物的设计36
• 2.2.3 RNAi慢病毒重组质粒的构建36-37
• 2.2.4 慢病毒包装37-39
• 2.2.5 Lentivirus滴度测定39-40
• 2.3 结果40-45
• 2.3.1 SFRP5基因信息40-41
• 2.3.2 SFRP5 si RNA基因序列41
• 2.3.3 SFRP5-sh RNA载体质粒图谱41-42
• 2.3.4 SFRP5-sh RNA慢病毒载体质粒测序42-43
• 2.3.5 慢病毒共转染 293T细胞43-44
• 2.3.6 慢病毒滴度测定44-45
• 2.4 讨论45-46
• 2.5 小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 在学期间研究成果52-53
• 综述53-60
• 参考文献57-60
• 致谢60

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6 上海市肿瘤医院胰腺肝胆外科主任医师 虞先o，

本文编号：729119