自噬在维持卵巢癌干细胞特性中的作用

发布时间：2017-08-24 12:41

  本文关键词：自噬在维持卵巢癌干细胞特性中的作用

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【摘要】：目的： 观察卵巢癌干细胞的自噬活性,并明确自噬激活对维持卵巢癌干细胞干性特征的作用。 方法： 1.以浆液性卵巢癌3AO细胞株为亲本细胞,通过无血清悬浮培养的方法获得卵巢癌干细胞。收集卵巢癌干细胞,利用流式细胞术检测细胞表面标记分子CD24表达,采用qRT-PCR和Western blot技术分别检测干性标记物Nestin、Oct-4和Nanog的mRNA和蛋白表达。 2.采用Western blot检测3AO细胞和卵巢癌干细胞自噬相关蛋白Atg5和p62的表达；进一步用BafAl抑制溶酶体降解过程,一方面采用共聚焦荧光显微镜观察转染GFP-LC3质粒后细胞内GFP-LC3-Ⅱ阳性小泡数量的变化,另一方面,采用Western blot检测LC3-Ⅱ和P62表达变化,观察细胞自噬流的大小。 3.通过shRNA干扰自噬基因Atg5,采用自噬抑制剂BafAl和CQ分别抑制卵巢癌干细胞自噬活性,首先用96孔板球囊形成实验,观察细胞自我更新能力的变化；再通过流式细胞术检测细胞表面标记物CD24的变化；最后利用CCK8检测细胞对紫杉醇的敏感性。 结果： 1.3AO卵巢癌细胞株通过无血清添加生长因子悬浮培养7天左右可以获得CD24(-)表型为的卵巢癌干细胞,并且高表达干性标记物Nestin. Oct-4和Nanog。 2.和卵巢癌细胞相比,卵巢癌干细胞自噬合成蛋白Atg5表达增加,而自噬降解蛋白p62表达降低；用溶酶体抑制剂BafAl抑制自噬降解后,一方面,卵巢癌和卵巢癌干细胞在共聚焦显微镜下GFP-LC3-Ⅱ日性小泡数量均发生累积,但是卵巢癌干细胞累积效果更明显；另一方面,抑制自噬降解后,两种细胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表达均增加,但是卵巢癌干细胞增加更显著。 3.抑制自噬后,卵巢癌干细胞的自我更新能力降低(所形成的球囊直径变小、数量变少)、CD24(+)表型的细胞比例上升、对紫杉醇的敏感性增加。 结论： 1.卵巢癌干细胞具有更强的自噬活性。 2.自噬激活有助于维持卵巢癌干细胞的干性特性。
【关键词】：卵巢癌 肿瘤干细胞 自噬 自噬流
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 缩略词9-11
• 前言11-17
• 参考文献15-17
• 1 仪器设备和试剂17-23
• 2 材料与方法23-32
• 3 结果32-41
• 4 讨论41-46
• 5 结论46-47
• 参考文献47-49
• 综述49-59
• 参考文献56-59
• 作者简历59

【参考文献】

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1 Si-Zhao Lu;Duygu Dee Harrison-Findik;;Autophagy and cancer[J];World Journal of Biological Chemistry;2013年03期

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本文编号：731371