线粒体基因ND1和ND3在结直肠癌中的调控机制研究

发布时间：2017-08-25 01:15

  本文关键词：线粒体基因ND1和ND3在结直肠癌中的调控机制研究

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【摘要】：线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所,其氧化磷酸化产物ATP是生命活动的主要能量来源。近年来的文献报道提示线粒体基因ND1、ND3在结直肠癌的癌组织和癌旁组织中存一定的删缺概率。ND1和ND3蛋白亚基作为呼吸链中复合物Ⅰ的重要组成部分,参与氧化磷酸化产能的关键步骤。呼吸链上基因异常导致的细胞能量代谢紊乱是癌症发病的诱因之一。这强烈预示着线粒体基因ND1、D3可能参与结直肠癌调控,但其具体的调控机制尚不清楚。本研究分别在细胞水平和组织水平对比了人结直肠癌细胞和正常肠上皮细胞,人结直肠癌组织和癌旁组织,发现了ND1和ND3基因在转录和蛋白表达水平的差异。并在5株结直肠癌细胞中遴选出了HT29和HCT116作为主要研究对象,使用SiRNA干扰的方式在HT29和HCT16中对NDl和ND3基因进行了干扰下调实验,MTS实验结果显示下调ND1或ND3后细胞增殖活力均有下降。Western Blot结果显示调节ND1对PGC1a具有下调,对COXⅣ蛋白的表达具有上调作用,ND3对PGCla和COXIV蛋白的表达具有下调作用,且ND1和ND3的蛋白表达量之间也存在相互影响。应用BrdU和PI染色结合流式检测结果显示Si干扰ND1和ND3后的细胞较NC组在第20至24小时之间有增殖滞后现象,同时干扰ND1和ND3后G0/G1期细胞增加,增殖周期明显滞后。而且下调ND1和ND3基因后检测到ATP下降,ROS降低,COX Ⅰ的活性也相应降低。上述研究表明,在HT29和HCT116细胞中下调ND1、ND3基因后细胞的增殖活性均受到一定抑制,细胞增殖周期干扰后有滞后现象。同时ATP、ROS、复合物Ⅰ以及能量代谢相关基因VDAC、PGCla、COX4的蛋白表达量也发生了相关变化,这对进一步了解结直肠癌的发病机制及治疗方法提供了理论基础。
【关键词】：线粒体 结直肠癌 ND1 ND3 BrdU
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 缩略词对照表7-12
• 第一章 前言12-22
• 1 线粒体介绍12-14
• 1.1 线粒体的发现历史12
• 1.2 线粒体基因结构12-13
• 1.3 线粒体生理功能及相关研究13-14
• 2. 线粒体基因与能量代谢14-17
• 2.1 线粒体氧化呼吸链14-16
• 2.2. 线粒体功能与肿瘤16
• 2.3 线粒体基因ND1、ND3的结构与功能16-17
• 3.17-18
• 3.1 结直肠癌研究现状17
• 3.2 结直肠癌检测方法17-18
• 3.3 结直肠癌发病相关基因18
• 4. RNAi干扰技术及BrdU标记方法18-21
• 4.1 RNAi的作用机制18-20
• 4.2 BrdU掺入标记20-21
• 5. 研究的目的及意义21-22
• 第二章. 材料与方法22-41
• 1 实验材料22-25
• 1.1 细胞株22-23
• 1.2 主要试剂耗材23-24
• 1.3 主要仪器24-25
• 2. 组织水平检测实验方法25-32
• 2.1 结直肠癌病理组织水平ND1、ND3基因差异性检测实验25-26
• 2.2 荧光定量PCR检测病理组织中MT-ND1、MT-ND3表达情况26-28
• 2.3 Western Blot检测组织水平中ND1、ND3表达差异28-32
• 3 细胞水平检测实验方法32-35
• 3.1 细胞培养32-33
• 3.2 细胞铺板33
• 3.3 PCR扩增mtND1、mtND3的全长目的基因序列33-34
• 3.4 实时荧光定量PCR检测6株细胞ND1、ND3表达情况34-35
• 3.5 Western Blot检测六株细胞中ND1、ND3的蛋白表达量35
• 4. HT29、HCT116细胞株ND1/ND3干扰下调后相关项目检测实验35-41
• 4.1 HT29、HCT116细胞株SiND1/SiND3干扰片段筛选实验36-37
• 4.2 转染效率检测37
• 4.3 RT-PCR检测并筛选干扰片段干扰效率37
• 4.4 Weasten Bolt检测干扰并筛选干扰片段效率37-38
• 4.5 ND1 ND3基因下调对HT29、HCT116细胞增殖活性的影响38
• 4.6 流式检测细胞周期38-39
• 4.7 BrdU掺入联合PI染色监测细胞增殖周期39
• 4.8 细胞ATP检测实验39-40
• 4.9 ROS检测40
• 4.10 线粒体复合物Ⅰ活性检测40-41
• 第三章. 结果与分析41-65
• 1. 结直肠癌病理组织ND1、ND3基因差异检测结果41-44
• 1.1 CRC病理组织中ND1、ND3全长片段PCR对比结果42
• 1.2 CRC病理组织中ND1、ND3定量Q-PCR检测结果42-43
• 1.3 CRC病理组织中ND1、ND3蛋白表达量检测结果43-44
• 2. 结直肠癌细胞株差异性检测结果44-46
• 2.1 结直肠癌细胞株基因组ND1、ND3全长片段PCR对比结果44
• 2.2 结直肠癌细胞株ND1、ND3定量qRT-PCR检测结果44-45
• 2.3 结直肠癌细胞ND1、ND3蛋白表达量检测结果45-46
• 3. HT29、HCT116细胞株ND1、ND3 SiRNA干扰筛选结果46-51
• 3.1 SiRNA转染结果47-49
• 3.2 干扰效率检测49-51
• 4. 下调ND1基因和ND3基因后细胞水平相关检测结果51-65
• 4.1 下调ND1后HT29、HCT116细胞增殖活力检测结果52
• 4.2 下调ND3后HT29、HCT116细胞增殖活力检测结果52-53
• 4.3 细胞周期检测结果53-56
• 4.4 下调ND1、ND3后BRDU&PI双染监测细胞增殖周期结果56-60
• 4.5 下调ND1、ND3后细胞ATP含量变化检测结果60-61
• 4.6 下调ND1、ND3后细胞ROS含量变化检测结果61-62
• 4.7 下调ND1、ND3后细胞线粒体复合物Ⅰ活性变化检测结果62-64
• 4.8 下调ND1、ND3基因后对细胞能量代谢相关蛋白表达的影响64-65
• 第四章. 讨论65-67
• 1. 线粒体基因差异表达65
• 2. 线粒体基因ND1和ND3与细胞增殖的关系65-66
• 3. BrdU联合P1分析细胞增殖速率66-67
• 第五章. 结论67-68
• 附录一 相关试剂配制方法68-70
• 附录二 SiRNA序列70-72
• 参考文献72-80
• 硕士期间科研成果及参与项目情况80-82
• 致谢82

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