SFRP5沉默对人胆管癌细胞生物学特性的影响

发布时间：2017-08-25 17:32

  本文关键词：SFRP5沉默对人胆管癌细胞生物学特性的影响

  更多相关文章： SFRP5 胆管癌 信号传导 靶基因修复

【摘要】：研究目的:探讨使用慢病毒介导短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)沉默SFRP5(secreted frizzled-related proteins-5,SFRP5)基因对人类胆管癌RBE细胞株增殖、迁移以及细胞周期和细胞凋亡的影响。研究方法:对人胆管癌RBE细胞株进行体外培养,制备设计SFRP5干扰片段,使用慢病毒载体p LVX-sh RNA2构建慢病毒载体质粒,并进行基因测序鉴定,将构建好的慢病毒sh RNA载体以及辅助质粒共同转染293T细胞获得重组慢病毒,利用梯度测定法测定慢病毒滴度,使用Fu GENE?HD转染试剂将慢病毒转染入RBE细胞株,获得稳定转染的RBE细胞株,利用Western blot印迹法检测SFRP5-si RNA干扰组以及对照组的SFRP5蛋白表达水平变化,通过细胞免疫荧光染色检测SFRP5在RBE细胞中的表达情况,利用Real-time PCR检测SFRP5-si RNA干扰组以及对照组m RNA表达水平的变化,通过Transwell细胞迁移实验以及细胞划痕实验研究SFRP5沉默对胆管癌细胞的迁移能力的变化,使用CCK-8法检测SFRP5低表达对胆管癌细胞增殖水平的影响,利用流式细胞术检测SFRP5低表达对胆管癌细胞周期以及细胞凋亡的影响。实验结果:细胞免疫荧光结果显示RBE细胞株呈SFRP5阳性,故使用RBE细胞实行后续实验,将慢病毒RNA干扰慢病毒载体及其辅助包装原件载体质粒共转染进293T细胞后,在荧光倒置显微镜下可见转染成功的293T细胞表达绿色荧光,慢病毒浓缩后测得滴度为1×109 TU/ml,测序结果呈阳性;重组慢病毒成功转染RBE细胞,48h后通过荧光倒置显微镜可见绿色荧光,转染效率约达90%;Western blot结果显示,与对照组对比,SFRP5-si RNA干扰组组蛋白表达明显抑制,同时RT-PCR结果显示,SFRP5-si RNA干扰组细胞株SFRP5基因m RNA表达水平明显降低(p=0.0087),证实重组SFRP5慢病毒载体能够有效抑制RBE细胞m RNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测结果显示,与对照组对比,SFRP5-si RNA干扰组增殖活性明显增加(p0.05);同时Transwell法检测结果显示,SFRP5-sh RNA-RBE组的穿膜细胞数约为[(310±15.63)个],较NC-sh RNA-RBE组的穿膜细胞数[(75±8.6)个]明显增加(p0.05);同时细胞划痕实验结果显示划痕后的12h及24h时,SFRP5-si RNA干扰组细胞迁移率显著大于对照组(p0.05);流式细胞术检测结果显示,SFRP5-si RNA干扰组细胞凋亡率(2.3%)明显低于对照组(12.3%),且处于G1期的SFRP5-si RNA干扰组细胞多于对照组(p0.05)。结论:SFRP5可能在肝内胆管癌的发生发展中起到重要的调节作用,SFRP5低表达激活wnt信号通路,促进肿瘤的发生发展。通过上述实验结果,本文得出以下结论:人肝内胆管癌RBE细胞株中,沉默SFRP5基因表达可显著增强RBE细胞的增殖和迁移能力,SFRP5的沉默抑制细胞凋亡,SFRP5在胆管癌细胞RBE中起到抑癌作用。
【关键词】：SFRP5 胆管癌 信号传导 靶基因修复
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.8
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词7-9
• 前言9-12
• 第一部分 SFRP5慢病毒载体的设计以及构建12-22
• 1.1 实验材料12-14
• 1.2 实验方法14-18
• 1.3 实验结果18-21
• 1.4 实验小结21-22
• 第二部分 沉默SFRP5基因对人类胆管癌的影响22-34
• 2.1 实验材料22-23
• 2.2 实验方法23-29
• 2.3 实验结果29-33
• 2.4 实验小结33-34
• 讨论34-37
• 结论37-38
• 参考文献38-40
• 综述：分泌型卷曲相关蛋白家族在肿瘤中的研究进展40-46
• 参考文献44-46
• 在学期间的研究成果46-47
• 致谢47

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 戴辉,窦科峰,李开宗,仇凯,陈勇,岳树强,侯小娟,陈志南;β-葡萄糖醛酸酶前药对βG基因转染人胆管癌细胞的作用[J];中华实验外科杂志;2001年02期

2 巩鹏,王忠裕,王洪江,谭广,殷朔;肿瘤坏死因子基因转染对人胆管癌细胞生长的影响[J];中华实验外科杂志;2004年01期

3 张丰深,郑秀海,马宽生,王曙光;胆囊收缩素对人胆管癌细胞粘附、运动及侵袭能力的影响[J];消化外科;2005年04期

4 郭伟,邹声泉;神经生长因子对人胆管癌细胞增殖作用的影响[J];中国普通外科杂志;2005年08期

5 郭伟;邹声泉;;神经生长因子对人胆管癌细胞体外侵袭力影响的研究[J];中华普通外科杂志;2006年01期

6 韩瑞;曹景玉;姜海涛;隋爱华;范友杰;李衍彦;;血卟啉光动力对人胆管癌细胞转移潜能影响实验研究[J];中华肿瘤防治杂志;2014年02期

7 吴高松,罗先文,刘正人,王欣,汤聪,邹声泉;胰胆管合流异常患者胆汁对人胆管癌细胞生长的影响[J];中华实验外科杂志;2003年05期

8 陈华,何振平,马宽生,王曙光;生长抑素类似物诱导人胆管癌细胞株凋亡及对胞内游离钙的影响[J];第三军医大学学报;2002年05期

9 曹智刚;郭启勇;马力;何东风;金罡;;热化疗对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响[J];中国医学影像技术;2006年06期

10 吴涛,窦科峰,李开宗;全反式维甲酸诱导人胆管癌细胞凋亡的作用[J];第四军医大学学报;2002年14期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 赵亚刚;张宏斌;张学庸;周兰;周梅花;惠宏襄;;HSV-tk基因联合GCV对人胆管癌细胞的杀伤作用[A];第六次全国中西医结合实验医学学术研讨会会议论文集[C];2002年

2 梁军才;缪林;张秀华;游思洪;何伟;;蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939增殖及cyclin E和p27蛋白表达影响的研究[A];第二十二届全国中西医结合消化系统疾病学术会议暨消化疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2010年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 范毓东;切割bcl-2 mRNA核酶对人胆管癌细胞的促凋亡作用[D];第四军医大学;2000年

2 傅赞;p15、p16在胆系癌中表达及对人胆管癌细胞增殖影响的实验对比研究[D];南京医科大学;2003年

3 樊钟琦;ABT737通过影响线粒体动力学增加人胆管癌细胞对顺铂敏感性[D];吉林大学;2015年

4 段世刚;胆管癌67kDa层粘素受体调控Fas配体表达的分子机制研究[D];第三军医大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 付勇超;大蒜素制剂抑制人胆管癌细胞株生长增殖的体外实验研究[D];昆明医科大学;2015年

2 黄U，

本文编号：737647