miR-495调控TSPAN12在小细胞肺癌耐药和增殖中的作用研究

发布时间：2017-08-26 01:49

  本文关键词：miR-495调控TSPAN12在小细胞肺癌耐药和增殖中的作用研究

  更多相关文章： TSPAN12 SCLC 多药耐药 miR-495

【摘要】：研究背景最新统计资料显示,在全球范围内,肺癌是首要的癌症死亡原因,同时也是男性和女性第二个最常见的恶性肿瘤。目前,肺癌的发病率仍然呈持续上升的趋势。国家卫生和计划生育委员会发布的((2013中国肿瘤登记年报》在对全国216个登记处的1.58亿人进行数据统计分析后也表示：肺癌已位居我国居民恶性肿瘤发病率和死亡率首位,是我国发病率和死亡率增长速度最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌按照细胞类型分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两类,其中SCLC约占全部原发性肺癌的20%。小细胞肺癌的发生可能与多种基因相关,包括原癌基因如Bcl-2、myc、ras、c-erbB-2基因等,抑癌基因如p53、视神经母细胞瘤基因(RB基因)、CDKN2及FHIT基因等；此外,有研究表明SCLC的发生还与信号通路PI3K/AKT/mTOR和抗凋亡基因caspase-8甲基化等因素相关。目前认为小细胞肺癌起源于支气管粘膜或其腺上皮内的Kulchitsky细胞(嗜银细胞),该细胞呈类圆形或梭形,胞浆稀少,富含多巴脱羧酶(L-dopa decarboxylase)、蛙皮素(bombesin)及神经元特异性烯醇化酶(enzyme neuron-specific enolase)等神经内分泌颗粒,属于APUD (amine precursor uptake decarboxylation)瘤。小细胞肺癌细胞分化程度低,恶性程度高,生长速度较快,倍增时间短,转移发生早而广泛(按照美国退伍军人医院肺癌研究小组制定的SCLC分期系统,大约有三分之二的小细胞肺癌患者在确诊时已经处于广泛期),临床上多采用以化疗为主的综合手段进行治疗。虽然癌细胞对化学治疗和放射治疗敏感,初次治疗缓解率高,但SCLC极易发生获得性耐药而复发,预后不良。目前小细胞肺癌的控制仍然不理想,寻找影响癌细胞增殖和药物敏感性的关键分子,可让我们对该肿瘤的发生发展机制有更深入的了解,并期望为临床医学研究提供理论基础。跨膜四蛋白(tetraspanin)家族是一类进化保守的细胞膜蛋白,广泛表达于不同物种中。在人类中,研究人员已发现33个该蛋白家族成员,它们均具有典型的4个高度疏水的跨膜结构域(transmembrane domain 1-4, TM1-4),两侧处于胞浆内的N末端和C末端。目前关于跨膜四蛋白家族的研究仍处于起始阶段,一般认为该蛋白分子可与多种整合素、生长因子及其受体、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分子和主要组织相容复合物(major histocompatibility complex, MHC)等内源性细胞表面蛋白分子相连,形成富tetraspanin微区(tetraspanin enrich microdomains, TEMs),在连接细胞膜内外信号上起到通信平台作用,从而参与调控细胞增殖、迁移及粘附等多种生命活动。另外,在高等脊椎类动物中,跨膜四蛋白还被发现参与病原体的识别与进入和肿瘤细胞的分化、迁移及侵袭等过程。TSPAN12 (Transmembrane 4 superfamily member 12, also Tetraspan NET-2)作为人类跨膜四蛋白家族重要成员之一,是视网膜血管形成的关键调控因子,主要与家族性渗出性玻璃体视网膜病变familial exudative vitreoretinopathy, FEVR)等疾病过程相关。同时,TSPAN12也是人类33个跨膜四蛋白中对肿瘤生物学活性起调节作用的分子之一。Wachi S等利用芯片技术发现,TSPAN12基因在肺癌、乳腺癌及前列腺癌等多种人类肿瘤中表达异[20-23]；Knoblich K等研究发现TSPAN12可通过β-catenin信号途径促进乳腺癌细胞体内增殖过程而抑制癌细胞转移；Otomo R等研究人员发现基质细胞中P53基因突变所致的TSPAN12表达上调可促进基质旁癌细胞的增殖、侵袭及转移过程。TSPNA12可能对肿瘤的发生发展起着促癌因子的作用,然而该基因是否参与小细胞肺癌发生发展尚未有报道。本课题组对小细胞肺癌耐药细胞株和化疗敏感细胞株进行基因芯片分析发现,与敏感株对比,TSPAN12在耐药株中表达较高,提示TSPAN12可能参与小细胞肺癌发生发展过程,并与癌细胞耐药的发生有关。本课题拟探讨TSPAN12在小细胞肺癌增殖和耐药中的作用,从而加深我们对SCLC化疗抗药性发生机制的认识,并期望为小细胞肺癌提供新的治疗靶点。MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子,长度为20-24个核苷酸,在物种进化过程中具有高度的保守性。同时,miRNA的表达模式具有分化位相性和时序性,提示该类分子可能是细胞分化和发育的重要调节因子。成熟的miRNA分子是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生,它无法进一步转译成蛋白质,但是可以与其他蛋白质(如Argonaute蛋白和Dicer酶)结合组装成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC通过碱基互补配对的方式形成miRNA-RISC蛋白复合体,后者与靶基因序列的3'UTR区进行特异性结合,根据miRNA和靶基因转录体两者的互补程度不同指导RNA诱导的沉默复合体进行切割InRNA或阻遏mRNA翻译,从而参与胚胎早期发育、增殖、凋亡及分化等重要生命过程[29-34]。生物信息学预测系统的结果显示,一个miRNA可以结合并调控多个靶基因,而同一个基因又可以同时接受多个miRNA分子的精细调节,miRNA与其靶基因形成一个复杂的基因调控网络并影响着生命进程的多个环节。有研究发现,miRNA可作为原癌基因或抑癌基因参与人类肿瘤的发生发展过程,如bantam miRNA是第一个被发现具有原癌基因功能的miRNA。同时,多种肿瘤相关基因的表达接受miRNA的调节,Kedmi M等发现miR-15b可以靶向调节肿瘤转移抑制基因MTSS 1的表达从而促进乳腺癌侵袭转移；Kim BK等研究结果显示miR-199a-5p可以负性调节FZD6的表达并参与结直肠癌的发生过程[40]；Sun Y等研究结果表明miR-126可以正向调节EGFL7的表达并抑制非小细胞肺癌增殖[41]；Zeng X等研究提示niR-200b可以通过调节ZEB2的表达来参与小细胞肺癌多药耐药形成过程。miR-495是位于人类染色体14q32.31位点上的一个非编码RNA分子,已有学者发现miR-495是胚胎发育和肿瘤发生发展的重要调控因子之一,主要参与调控间充质干细胞分化及多种肿瘤的增殖、迁移、侵袭等生物学行为。另外,有研究结果提示miR-495还参与调节肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,Song L等研究发现miR-495可以通过调节非小细胞肺癌中ATP7A的表达影响其对铂类化疗药物的敏感性;Xu Y等发现miR-495可以下调MDR1的表达并参与白血病多药耐药的形成。本课题组早期对小细胞肺癌耐药株和敏感株进行基因芯片分析发现,miR-495在耐药细胞中表达明显较敏感株低,并且发现miR-495可能通过诱导SCLC细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)参与小细胞肺癌耐药的发生。生物信息学软件分析发现,miR-495与TSPAN12存在共同结合位点,提示TSPAN12可能是miR-495的靶基因之一,后者可能通过靶向TSPAN12参与SCLC多药耐药的发生。Wnt信号转导通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号途径。经典的Wnt信号通路主要由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜蛋白(FZD)、Dishevelled (Dsh)蛋白、(3-catenin蛋白、P-catenin降解复合体(包括APC蛋白、糖原合成酶激酶GSK3β蛋白、Axin蛋白及β-catenin蛋白)及TCF/LEF家族转录调节因子等构成。Wnt通路的激活经历以下过程：Wnt蛋白与细胞膜受体结合后,通过磷酸化的Dsh蛋白将信号传至细胞内,抑制β-catenin降解复合体活性,β-catenin活化并在细胞质中大量聚集,当β-catenin达到一定水平后向细胞核转位,与TCF/LEF家族的转录因子结合,从而激活靶基因的转录。大量研究表明,Wnt信号参与了早期胚胎发育、器官形成、组织再生及上皮细胞间充质转化等生理过程。然而在视网膜血管形成的研究中,有学者表示β-catenin蛋白的活化可以不依赖Wnt信号。其中Junge H等研究人员发现TSPAN12分子可以直接与Norrin蛋白结合,通过聚集并活化FZD4蛋白来抑制β-catenin蛋白的降解过程,β-catenin蛋白在细胞质中积聚并进入细胞核内,从而启动下游基因的转录。已有研究结果显示,Wnt/β-catenin信号通路的异常活化可以诱导肿瘤发生。而Knoblich K等研究发现,TSPAN12可诱导P-catenin信号的激活,并提高乳腺癌细胞体内成瘤能力。综上所述,基于前期小细胞肺癌基因芯片结果,我们提出以下假说,TSPAN12在miR-495的调控下,通过Norrin/β-catenin信号途径参与小细胞肺癌的发生发展及多药耐药。实验目的通过筛选小细胞肺癌耐药株(H69AR)和化疗敏感株(H69)中具有差异表达的基因,选择表达显著上调的基因TSPAN12进行研究,分析其对癌细胞增殖和药物敏感性的影响及调控机制,进一步丰富小细胞肺癌多药耐药的分子机制,为临床治疗提供理论依据。研究内容1.分析小细胞肺癌耐药细胞H69AR和敏感株H69中TSPAN12基因表达的差异性,并取另一对细胞H446/CDDP和H446进行验证；2.分析TSPAN12对SCLC癌细胞药物敏感性和增殖的影响；3.分析SCLC耐药细胞H69AR和敏感株H69中miR-495的表达差异性及其对TSPAN12的调节作用；4.分析TSPAN12对β-catenin信号通路活化的影响。研究方法：1.cDNA基因芯片分析SCLC多药耐药细胞H69AR和敏感株H69中具有差异表达的基因,选择tetraspanin家族中表达显著差异的TSPAN12,通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和western blotting技术验证TSPAN12在两株细胞中mRNA和蛋白水平上的表达差异；取另一对细胞(I1446/CDDP、H446)共同验证基因芯片的结果。2.利用shRNA降低SCLC耐药株H69AR和H446/CDDP中TSPAN12表达水平,CCK-8法分析癌细胞对小细胞肺癌常用化疗药物顺铂(Cisplatin, DDP)和足叶乙甙(Etoposide, VP-16)的敏感性变化；分别利用CCK-8法和平板克隆实验分析下调TSPAN12表达后H446/CDDP细胞的增殖变化；流式细胞术分析shRNA转染前后细胞凋亡和周期的变化。3.利用miRNA芯片技术分析SCLC耐药细胞H69AR和敏感株H69中差异表达的nicroRNA,通过生物信息学软件(microRNA.org)分析TSPAN12相关miRNA,选择表达差异显著的miR-495进行研究,通过qRT-PCR技术验证H69AR、H446/CDDP及其相应亲本中miR-495的表达差异性。4.通过构建miR-495 mimics和miR-495 inhibitors增加或抑制耐药株(H69AR、 H446/CDDP)及其亲本细胞中miR-495的表达水平,利用qRT-PCR技术验证转染效果,然后分别利用qRT-PCR和vvestern blotting技术在mRNA和蛋白水平检验转染后细胞中TSPAN12基因表达的情况。5.利用qRT-PCR和western blotting技术分析下调TSPAN12后SCLC细胞H446/CDDP中P-catenin在mRNA和蛋白水平上的表达变化；通过免疫荧光实验分析下调TSPAN12前后细胞中β-catenin的分布情况。统计学分析：实验结果均经SPSS 13.0软件统计。各实验至少独立重复3次,数据以平均数±标准差(x±s)表示。耐药株及其亲本间TSPAN12或miR-495表达的比较采用两独立样本t检验；多组间细胞周期或凋亡比较采用one-way ANOVA(方差齐同时)或Welch法(方差不齐时),多重比较采用Dunn ett法(方差齐同时)或Dunnett's T3法(方差不齐时)。CCK-8实验结果采用析因设计资料的方差分析,多重比较采用SNK法。以P0.05表示有统计学意义。研究结果：1.cDNA芯片结果显示TSPAN12在SCLC耐药株H69AR中的表达是敏感株H69中的3.15倍,(RT-PCR结果(4.66倍,P=0.033)和western blotting结果(1.50倍,P=0.01)；在H446/CDDP和H446细胞中qRT-PCR结果(2.15倍,P=0.028)和、vestern blotting检测(1.77倍,P0.001),验证了基因芯片的结果。2.设计针对TSPAN12的shRNA寡核苷酸,利用lipofectamin 2000转染H446/CDDP细胞,提取总RNA和总蛋白,qRT-PCR实验结果显示转染TSPAN12-1082和TSPAN12-748后细胞中TSPAN12 mRNA水平分别下降至原来的28.6667%(P0.001)和65.333%(P=0.019),结果与western blotting的一致,选取转染TSPAN12-1082进行后续实验。3.CCK-8法分析癌细胞药物敏感性结果显示：转染TSPAN12-1082后H69AR和H446/CDDP对化疗药物(顺铂和足叶乙甙)的生存率下降,IC50值亦相应减小,但P0.05,没有统计学差异。4.CCK-8法检测转染TSPAN12-1082后H446/CDDP细胞在不同时间点生存率的变化,结果显示TSPAN12下调后H446/CDDP细胞增殖速率显著减慢(P0.05)；进一步通过平板克隆实验进行验证,显示TSPAN12下调后细胞形成克隆能力显著下降(P=-0.022)。5.利用流式细胞术对转染TSPAN12-1082后H446/CDDP细胞周期的变化,结果发现TSPAN12下调可引起细胞发生G0/G1期阻滞(P=0.01)；在细胞凋亡方面,下调TSPAN12可促进药物对细胞诱导的凋亡(P-=0.002)。6.利用miRNA芯片技术发现SCLC多药耐药株H69AR中miR-495较敏感株I-169中的明显下调(后者约为前者的4.51倍),qRT-PCR结果(0.32667倍,P=0.017),取H446/CDDP和H446细胞共同验证,qRT-PCR结果(0.24667倍,P=0.016),芯片结果得以验证。7.利用microRNA靶基因预测软件检测发现miR-495的基因序列能与TSPAN12 mRNA的3’-UTR部分互补配对,转染miR-495mimics后H69AR细胞中miR-495表达上调3.31倍(P=-0.018),qRT-PCR示TSPAN12下调至其亲本的0.67倍(P=0.045),蛋白水平上TSPAN12下调0.57倍(P0.001)；而转染miR-495 inhibitors后H69细胞中miR-495表达下调至0.42倍(P--0.017),TSPAN12在mRNA水平上增加4.76倍(P=-0.018),蛋白水平上增加2.58倍(P0.001)；在H446/CDDP和H446细胞中重复相同实验也得到类似结果。8.H446/CDDP转染TSPAN12-1082后,通过qRT-PCR检测,结果显示中β-catenin及其下游基因MYC和CyclinD1表达分别下调0.47倍、0.48倍及0.38倍(P0.05), western blotting结果显示转染TSPAN12后β-cateni n下调0.72倍(P0.05)；在H69和H69AR细胞中重复相同实验得到一致的结果。免疫荧光实验显示TSPAN12下调后细胞核内分布的β-catenin蛋白减少。结论：1. TSPAN12在SCLC多药耐药细胞H69AR中表达上调,降低细胞中TSPAN12的表达可以增加癌细胞对化疗药物的敏感性并抑制癌细胞增殖,提示TSPAN12可能是小细胞肺癌发生发展的一个促癌因子,但不是调节小细胞肺癌耐药的关键因素。2. TSPAN12可以影响SCLC癌细胞周期及其对化疗药物诱导的细胞凋亡。3.miR-495在SCLC多药耐药细胞H69AR中表达下调,降低或增加miR-495可以下调或上调TSPAN12的表达,提示TSPAN12可能是miR-495的靶基因。4.降低TSPAN12在癌细胞中的表达可以下调P-catenin及其下游基因的表达,并抑制β-catenin蛋白向细胞核转移,提示TSPAN12可能通过活化β-catenin信号通路来影响SCLC的增殖和凋亡等过程。
【关键词】：TSPAN12 SCLC 多药耐药 miR-495
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-20
• 第一部分 TSPAN12对小细胞肺癌增殖和耐药性的作用20-56
• 第一章 前言20-22
• 第二章 材料和方法22-47
• 第三章 结果47-54
• 第四章 讨论54-56
• 第二部分 miR-495对TSPAN12的调节作用56-63
• 第一章 前言56-59
• 第二章 材料和方法59
• 第三章 结果59-62
• 第四章 讨论62-63
• 第三部分 TSPAN12与β-catenin信号通路的关系63-70
• 第一章 前言63-65
• 第二章 材料与方法65-66
• 第三章 结果66-69
• 第四章 讨论69-70
• 全文小结70-71
• 参考文献71-79
• 攻读学位期间成果79-80
• 中英文缩写词对照表80-81
• 致谢81-82

【共引文献】

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