染料木黄酮与内源性雌二醇对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D双向作用后差异表达基因的筛选与验证分析

发布时间：2017-08-27 05:32

  本文关键词：染料木黄酮与内源性雌二醇对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D双向作用后差异表达基因的筛选与验证分析

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【摘要】：目的乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,严重影响患者的生存质量。现认为乳腺癌的发病是许多基因异常表达的结果,寻找乳腺癌发生过程中表达水平发生变化的基因及阻止肿瘤发生发展的靶点成为腺癌研究中亟待解决的难题。大豆染料木黄酮作为大豆食品中重要的活性成分,主要产生雌激素和抗雌激素作用来体现其抗乳腺癌活性,使乳腺癌的发病率不断下降,受到了人们的广泛关注。其作为类雌激素与人体内源性激素对女性乳腺癌的共同影响是决定其防控乳腺癌作用效果的关键点,此外,雌激素受体类型不同,染料木黄酮生物学效应存在较大差别。本研究通过染料木黄酮与不同水平(80,800 pmol/L,妇女绝经前后)内源性雌二醇共同作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231口T47D,利用基因芯片高通量的优点,对染料木黄酮与内源性雌二醇双向作用于两株乳腺癌细胞后行差异表达基因的筛选与验证分析。获取不同雌激素受体下乳腺癌细胞的关键差异基因和信号通路,对差异表达基因作用路径进行分析,探讨可疑基因群中基因的作用通路以及基因之间的相互作用,找出染料木黄酮抑制乳腺癌作用的分子机制和对不同雌激素受体下乳腺癌细胞的抑制差异,为其在乳腺癌的预防、治疗上的应用提供科学证据。方法对前期所获得的雌二醇与染料木黄酮共同作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D后基因芯片数据进行归一化处理,根据倍数差异(FC≤0.5或FC≥2)和方差分析筛选差异性表达基因,FC≥2认为该基因表达上调,FC0.5认为该基因表达下调。通过DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)在线分析工具对这组差异表达基因进行基因功能的注释和基因富集分析,筛选出与肿瘤进展相关的功能类,在这些功能类中挑选差异倍数较高且参与多个功能类的基因进行实时荧光定量PCR验证。结果1、用不同浓度染料木黄酮与内源性雌二醇共同处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D后,对各处理组的基因芯片数据进行差异基因的筛选,筛选标准为P0.01, FC (Fold Chang)≥2或FC0.5。(1)当两株乳腺癌细胞中没有加入染料木黄酮,只是根据绝经前后身体里不同雌激素水平加入相对应的雌激素受试物80,800 pmol/L时。按照筛选标准,乳腺癌细胞MDA-MB-231中共有134个基因表达发生显著变化,其中上调98个,下调36个；乳腺癌细胞T47D中共有122个基因表达发生显著变化,其中上调85个,下调37个。(2)当两株乳腺癌细胞中加入染料木黄酮浓度为20μmol/L,雌激素水平根据绝经前后身体里不同浓度加入相对应的雌激素受试物即80,800 pmol/L时。按照筛选标准,乳腺癌细胞MDA-MB-231中共有395个基因表达发生显著变化,其中上调229个,下调166个；乳腺癌细胞T47D中共有503个基因表达发生显著变化,其中上调313个,下调190个。(3)当两株乳腺癌细胞雌激素浓度为绝经后(80Pmol/L)水平时,加入染料木黄酮浓度为20μmol/L时,可获得染料木黄酮对绝经后雌激素水平下两株乳腺癌细胞的影响结果。按照筛选标准,乳腺癌细胞MDA-MB-231中共有151个基因表达发生显著变化,其中上调57个,下调94个；乳腺癌细胞T47D中共有136个基因表达发生显著变化,其中上调50个,下调86个。(4)当两株乳腺癌细胞雌激素浓度为绝经前(800Pmol/L)水平时,加入染料木黄酮浓度为20μmol/L时,可获得染料木黄酮对绝经前雌激素水平下两株乳腺癌细胞的影响结果。按照筛选标准,乳腺癌细胞MDA-MB-231中共有56个基因表达发生显著变化,其中上调29个,下调27个；乳腺癌细胞T47D中共有80个基因表达发生显著变化,其中上调39个,下调41个。2、以受试物E2为0 pmol/L, Gen Oμmol/L作空白对照,受试物E2为0 pmol/L, Gen 20μmol/为试验组时,通过进行实时定量PCR实验验证,从实验组中筛选出的BRCA2、CDKN1A、ABAT、FAS、TP53TG3、SDCBP等6个基因表达水平比对照组显著上调,TNF基因表达水平显著下调,与芯片筛选结果一致；EGFR基因表达水平显著下调,芯片筛选结果不一致。结论Gen对ERa阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231无论是绝经前还是绝经后都起到保护作用；雌激素水平在绝经前时Gen抑制T47D的增殖和生长,雌激素水平为绝经后时Gen促进T47D生长。Gen对乳腺癌细胞的影响除跟体内雌激素水平相关外,还和乳腺癌细胞中ER的类型相关。主要表现在Gen对ER信号通路在磷酸化水平和转录水平上均产生一定的影响；具体表现为对雌激素受体ER-a的作用上,Gen阻止了ER-α第537位酪氨酸残基的磷酸化而抑制酪氨酸激酶活性,使ER二聚化不能形成,阻断其信号传递。
【关键词】：染料木黄酮 内源性雌激素 雌激素受体 乳腺癌细胞 差异基因
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 1 实验材料18-20
• 1.1 实验药品和试剂18
• 1.2 实验细胞株18
• 1.3 实验仪器和耗材18-20
• 2 实验方法20-27
• 2.1 细胞培养前的准备20-21
• 2.2 细胞株的培养和受试物的添加21-22
• 2.3 实时荧光定量PCR验证差异基因22-26
• 2.4 统计方法26-27
• 3 结果27-63
• 3.1 差异表达基因的筛选27-57
• 3.2 实时荧光定量PCR验证芯片结果57-63
• 4 讨论63-66
• 4.1 雌激素受体对乳腺癌细胞的影响作用63
• 4.2 不同雌激素水平下加入Gen时对乳腺癌细胞的影响63-64
• 4.3 染料木黄酮、雌激素和雌激素受体的交互作用64-66
• 5 结论66-67
• 参考文献67-71
• 综述71-78
• 参考文献75-78
• 攻读学位期间获得的学术成果78-79
• 致谢79

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本文编号：744611