前列腺癌AR复合体通过甲基化抑制YAP1的表达

发布时间：2017-08-27 06:00

  本文关键词：前列腺癌AR复合体通过甲基化抑制YAP1的表达

  更多相关文章： 前列腺癌 甲基化 Yes-相关蛋白1 雄激素受体 DNA甲基转移酶3a EZH2

【摘要】：目的:应用体内体外实验检测前列腺癌中雄激素受体(AR)对Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)的调节作用,并进一步探讨AR调节YAP1的作用机制。方法:应用免疫组织化学的方法分别检测三个时间点两种转基因鼠(AR-wt AR-KO)的YAP1的表达差异,应用蛋白免疫印迹(Western Blotting)的方法分别检测前列腺癌细胞中抑制AR(使用AR的抑制剂)和激活AR(过表达AR)后YAP1蛋白表达的变化,应用IHC及Western Blotting两种技术分别检测不同的人前列腺疾病标本(BPH、ADPC、CRPC)的YAP1的表达差异。应用实时定量PCR技术(qPCR)的方法检测敲低AR(通过siRNA)后YAP1及其下游基因的mRNA变化,应用Luciferase报告基因技术分别检测抑制AR(通过siRNA敲低AR以及使用AR的抑制剂两种不同的方法)和激活AR后YAP1的启动子区活性。应用甲基化特异性PCR(MSP)的方法检测雄激素依赖的AR对YAP1启动子区甲基化的调节作用。应用蛋白免疫印迹、qPCR和Luciferase报告基因技术分析依赖AR的DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)对YAP1的调节作用。应用染色质免疫沉淀技术(ChIP-MSP)验证DNMT3a、AR对YAP1的甲基化的调节作用。应用免疫共沉淀技术(CoIP)、染色质免疫共沉淀技术(ChIP-qPCR)验证AR、DNMT3a、EZH2三者的相互作用及其调节YAP1的机制。结果:1.前列腺癌中AR抑制YAP1的表达。人前列腺组织中,YAP1主要表达于AR阴性、CK5阳性的基底上皮细胞(basal epithelial cells)的核内,而高表达AR的腔上皮细胞(luminal cells)则表达极少量的细胞内弥散分布的YAP1。去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中YAP1的表达明显高于激素依赖性前列腺癌(ADPC)。2.qPCR结果证实敲低AR后,YAP1及其下游基因的mRNA上调。Luciferase报告基因实验证实抑制AR能提高YAP1的启动子区活性,而双氢睾酮(DHT)刺激AR能抑制YAP1的启动子区活性。3.MSP结果显示DHT激活AR后,YAP1启动子区CpG位点的甲基化水平上调,继而用MDV3100抑制AR活性后,上调的甲基化回落。4.DNMT3a在转录水平抑制YAP1的表达,这种抑制作用有赖于雄激素激活的AR,同时AR抑制YAP1的转录亦依赖DNMT3a,进一步的ChIP-MSP实验证实,相比于非甲基化位点,DNMT3a和AR更多地结合在YAP1的启动子区甲基化位点。5.CoIP实验证实AR、DNMT3a、EZH2互相结合形成复合体,ChIP-qPCR实验进一步证实AR-DNMT3a-EZH2复合体结合于YAP1的启动子区,并且这种结合是雄激素依赖性的。EZH2的抑制剂DZNep能抑制复合体的形成与发挥作用,相反地,H3K27去甲基化酶抑制剂GSKJ1能促进复合体的形成与发挥作用。结论:前列腺组织中,YAP1主要表达于基底上皮细胞的核内,而腔上皮细胞则表达少量的细胞内弥散分布的YAP1。CRPC中YAP1的表达明显高于ADPC。前列腺癌中AR能够抑制YAP1的表达,并且这种抑制作用依赖于AR与DNMT3a、EZH2相互结合形成复合体,此复合体结合于YAP1的启动子区,继而促进YAP1的启动子区CpG位点的甲基化。CRPC阶段,AR、DNMT3a和EZH2对YAP1的甲基化调节过程明显抑制,从而导致YAP1高表达,此过程对CRPC阶段前列腺癌细胞的生长至关重要,这也为我们提供了一个治疗CRPC的潜在靶点。
【关键词】：前列腺癌 甲基化 Yes-相关蛋白1 雄激素受体 DNA甲基转移酶3a EZH2
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-15
• 研究现状、成果11-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、Androgen-AR信号通路抑制YAP1表达15-33
• 1.1 对象和方法15-27
• 1.1.1 研究对象15-16
• 1.1.2 实验材料16-18
• 1.1.3 实验方法18-27
• 1.2 结果27-30
• 1.2.1 TRAMP鼠敲除AR后YAP1蛋白表达的变化27-28
• 1.2.2 前列腺癌细胞中改变AR活性后YAP1蛋白的变化28-29
• 1.2.3 不同人前列腺组织中YAP1的表达差异29-30
• 1.3 讨论30-31
• 1.4 小结31-33
• 二、AR与DNMT3a、EZH2形成复合体，甲基化抑制YAP133-53
• 2.1 对象和方法33-46
• 2.1.1 研究对象33
• 2.1.2 实验材料33-37
• 2.1.3 实验方法37-46
• 2.2 结果46-49
• 2.2.1 AR主要在转录水平调节YAP1的表达46-47
• 2.2.2 AR通过DNMT3a依赖的甲基化方式调节YAP147-48
• 2.2.3 AR与DNMT3a、EZH2相互结合在YAP1的启动子区48-49
• 2.3 讨论49-52
• 2.4 小结52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-57
• 发表论文和参加科研情况说明57-58
• 综述 YAP与多种恶性肿瘤相关性的研究进展58-74
• 综述参考文献66-74
• 致谢74-75
• 个人简历75

，

本文编号：744681