乳腺癌患者围化疗期免疫功能动态监测

发布时间：2017-08-28 22:38

  本文关键词：乳腺癌患者围化疗期免疫功能动态监测

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【摘要】：目的：探讨乳腺癌患者围化疗期免疫功能状态,为乳腺癌患者化疗联合生物免疫治疗的临床工作提供理论依据。方法：通过动态监测乳腺癌患者化疗前1天、化疗后第3天和第5天外周血来源的CIK细胞的生长增殖情况,在培养的21天内,其增殖能力、对K562的细胞毒活性、细胞表型和细胞因子的水平。用淋巴细胞分离液分离出乳腺癌患者化疗前1天、乳腺癌患者化疗后第3天和第5天外周血样本中的外周血单个核细胞,培养在RPMI-1640培养基(含10%FBS),添加IFN-γ,24小时后添加anti-CD3单克隆抗体(克隆号：OKT3)和IL-2,以后每2-3天添加RPMI-1640培养基和IL-2。分别在培养的第0、7、14、21天观察CIK细胞形态的变化,用台盼蓝染色计数活细胞量绘制增殖曲线；设3种效靶比：16：1、8：1、4：1,用MTS检测CIK细胞的细胞毒活性；用流式细胞术检测CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD3+CD56+T细胞亚群的比值；用ELISA检测TNF-α的分泌水平以及所有样本血浆中IL-2、IFN-γ和TNF-α的浓度。同时用健康人外周血和脐血作为对比,比较不同来源的样本各项免疫指标的差异。采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果：1、培养21天后五种来源的CIK细胞增殖倍数分别是：乳腺癌患者化疗前1天外周血(118.01±30.49)、乳腺癌患者化疗后第3天外周血(36.15±23.45)、乳腺癌患者化疗后第5天外周血(28.62±14.62)、健康人外周血(187.59±29.84)和脐血(279.07±33.19),乳腺癌患者化疗抑制自体来源的CIK细胞增殖,乳腺癌患者化疗前1天、乳腺癌患者化疗后第3天和第5天的样本与健康人样本相比具有显著性差异(P0.001),乳腺癌患者化疗后第3天和第5天的样本与乳腺癌患者化疗前1天样本相比也具有显著性差异(P0.001),但在CIK细胞形态上并没有明显不同。2、五种来源的CIK细胞毒性随培养天数的变化趋势相似,在培养第7天检测到CIK细胞毒活性最强,培养第14、21天其细胞毒活性有所降低,但要高于新鲜分离的PBMC的细胞毒活性,CIK细胞培养到第7、14、21天的细胞毒活性显示乳腺癌患者化疗后第3天和第5天的样本较弱。3、五种来源的CIK细胞在培养的21天内,它们CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD56+的表型随培养时间的变化趋势是一致的,培养至21天时乳腺癌患者化疗后第3天和第5天样本与健康人样本相比没有显著性差异。4、五种来源血浆中IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平比较,乳腺癌患者化疗前1天、乳腺癌患者化疗后第3天和第5天收集的血浆中IL-2、TFN-α和TNF-α的水平均低于健康人和脐血的样本,乳腺癌患者化疗前1天、乳腺癌患者化疗后第3天和第5天样本与健康人样本相比有显著性差异(P0.001)。5、五种来源CIK细胞在培养的第7、14和21天分泌TNF-α的水平比较,乳腺癌患者化疗前1天、乳腺癌患者化疗后第3天和第5天外周血来源的CIK细胞培养液上清中TNF-α的水平均低于健康人和脐血的样本,乳腺癌患者化疗前1天、乳腺癌患者化疗后第3天和第5天样本与健康人样本相比有显著性差异(P0.001)。结论：1、化疗后乳腺癌患者分泌IL-2、TFN-γ和TNF-α的功能以及自体来源的CIK细胞的增殖、细胞毒活性和分泌TNF-α的功能受到严重抑制。2、五种来源的CIK细胞其增殖、细胞毒活性、细胞表型和分泌的TNF-α随培养天数变化的趋势是一致的。3、乳腺癌患者化疗并不会影响自体来源的CIK细胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD56+的表型的表达。
【关键词】：乳腺癌 化疗 免疫功能 CIK细胞
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-16
• 缩略词16-18
• 第一章 绪论18-33
• 1.1 乳腺癌的发病率18-19
• 1.2 乳腺癌的治疗19-23
• 1.2.1 外科手术19
• 1.2.2 放射治疗19
• 1.2.3 系统治疗19-23
• 1.2.3.1 化疗20-22
• 1.2.3.2 激素治疗22
• 1.2.3.3 靶向治疗22-23
• 1.2.3.3.1 HER2靶向治疗22
• 1.2.3.3.2 其它靶向药物22-23
• 1.3 化疗的毒副作用23-26
• 1.3.1 免疫抑制23-25
• 1.3.1.1 T细胞的肿瘤免疫作用24
• 1.3.1.2 CD4~+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞功能24-25
• 1.3.2 化疗后CD4~+T淋巴细胞和CD8~+T淋巴细胞的变化25-26
• 1.4 CIK细胞治疗26-30
• 1.4.1 CIK细胞的免疫表型27
• 1.4.2 CIK细胞分泌的细胞因子27-29
• 1.4.2.1 IL-228
• 1.4.2.2 IFN-γ28-29
• 1.4.2.3 TNF-α29
• 1.4.3 CIK细胞免疫功能相关的基因表达29-30
• 1.4.4 CIK细胞的细胞毒活性30
• 1.5 乳腺癌化疗联合CIK细胞治疗30-31
• 1.6 研究目的、内容及意义31-33
• 1.6.1 研究目的31
• 1.6.2 研究内容31-32
• 1.6.3 研究意义32-33
• 第二章 材料与方法33-59
• 2.1 材料33-41
• 2.1.1 细胞33
• 2.1.2 耗材33-34
• 2.1.3 试剂34-35
• 2.1.4 主要试剂的配制35-40
• 2.1.4.1 RPMI-1640培养基的配制：1L35-37
• 2.1.4.2 胎牛血清的灭活37
• 2.1.4.3 完全培养基(含10%FBS)的配制37
• 2.1.4.4 缓冲液1×PBS的配制：1L37-38
• 2.1.4.5 缓冲液1×DPBS的配制：1L38-39
• 2.1.4.6 MTT工作液的配制：100ml39
• 2.1.4.7 MTS工作液的配制：21ml39
• 2.1.4.8 PMS工作液的配制：1ml39
• 2.1.4.9 CIK培养用细胞因子初浓度配制39-40
• 2.1.5 主要实验仪器40-41
• 2.2 实验方法41-59
• 2.2.1 细胞培养41-45
• 2.2.2 外周血(脐血)单个核细胞的分离45-48
• 2.2.3 细胞计数48-49
• 2.2.4 CIK细胞的培养49-51
• 2.2.5 CIK增殖曲线51
• 2.2.6 MTS检测CIK细胞毒活性51-53
• 2.2.7 CIK细胞表型检测53-55
• 2.2.8 ELISA实验55-58
• 2.2.9 统计学分析58-59
• 第三章 实验结果59-76
• 3.1 CIK细胞生长形态59-62
• 3.2 CIK细胞增殖曲线62-64
• 3.3 MTS法比较五种来源CIK细胞毒活性64-68
• 3.4 流式细胞术检测五种来源CIK细胞表型68-73
• 3.4.1 CD3~+的表达68-69
• 3.4.2 CD3~+CD4~+的表达69-70
• 3.4.3 CD3~+CD8~+的表达70-72
• 3.4.4 CD3~+CD56~+的表达72-73
• 3.5 ELISA法检测五种来源血浆中IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平73-74
• 3.6 ELISA法检测五种来源CIK细胞分泌TNF-α的水平74-76
• 第四章 讨论76-80
• 第五章 结论80-81
• 第六章 总结与展望81-82
• 致谢82-84
• 参考文献84-94
• 附录一 攻读硕士期间发表论文目录94-95
• 附录二 样本信息95-96

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