钌多吡啶配合物（Ru1）对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其分子机制研究

发布时间：2017-08-29 07:41

  本文关键词：钌多吡啶配合物（Ru1）对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其分子机制研究

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【摘要】：研究目的与意义铂类金属抗肿瘤药物在1978年成功上市应用后,将人们对抗肿瘤药物的研究兴趣吸引到了全新领域,从此开启了研究金属类抗肿瘤药的新纪元。但在临床使用铂类药物过程中,发现该类药物具有强烈的毒副作用,且抗肿瘤普窄等限制了该类药物的广泛使用。为了突破这些束缚,具有抗肿瘤活性强,抗肿瘤谱广且毒副作用小的新金属类抗肿瘤药成为了研究热点,学者们将思路转移到了在元素周期表中与铂同属Ⅷ族的钌金属,钌元素具有与铂类金属类似的理化特性,但毒副作用更低,被认为经过适当结构修饰后可成为最具前途的抗肿瘤药物之一。NAMI-A及KP1019两个钌配合物成功进入临床试验,更是激发了人们对钌金属的极大研究热情。科研人员对钌金属进行了大量的结构修饰,得到了大量新型的钌配合物,同时部分配合物具有较强的抑制肿瘤细胞增殖作用已经得到确认。我们课题组在前期工作中,观察了多种新合成钌多吡啶配合物的抗肿瘤活性,本实验将在原有工作基础上,选取钌多吡啶配合物([Ru(bpy)_2(taptp)](ClO_4)_2(Ru1)),进一步研究其对肿瘤细胞增殖的抑制作用,并探讨其作用相关机制本研究首先筛选对该新型钌多吡啶配合物(Ru1)敏感的肿瘤细胞,检测Ru1对细胞的抑制作用,从DNA损伤水平探讨其可能的作用机制,所得实验结果可为钌配合物的研究奠定基础,为设计开发、筛选高效和毒副作用低的金属类抗肿瘤药提供宝贵的理论和实验依据。研究方法钌配合物对肿瘤细胞增殖的影响本研究选取了SGC-7901、Hela、MDA-MB-231细胞为实验研究对象,各种肿瘤细胞经不同浓度的[Ru(bpy)_2(taptp)](ClO_4)_2(Ru1)处理24h后,采用MTT实验检测Ru1对受试肿瘤细胞的抑制率并计算IC50值;结晶紫染色法检测经配合物作用后肿瘤细胞数量变化情况,从中选取对Ru1较敏感的肿瘤细胞进行后续实验。肿瘤细胞对钌配合物的内吞作用以MTT实验工作为基础,将对配合物(Ru1)较为敏感的SGC-7901细胞作为实验对象,采用Ru1分别作用12h,通过DAPI染色,利用Ru1本身自带荧光与DAPI的荧光相互叠加对照,检测Ru1在SGC-7901细胞内的分布情况。钌配合物对SGC-7901细胞周期的影响为了深入研究Ru1抑制肿瘤细胞的分子机制是否与SGC-7901细胞周期相关联,故通过乙醇固定法联合流式细胞技术检测经过Ru1处理SGC-7901细胞24h后,细胞周期的分布情况。钌配合物对SGC-7901细胞DNA的影响为了进一步探究Ru1是否以DNA为作用靶标而发挥抑制肿瘤细胞的作用,通过彗星实验验证经过Ru1处理SGC-7901细胞24h后,细胞DNA的损伤程度。钌配合物对SGC-7901细胞凋亡的影响在探讨Ru1阻滞细胞周期进程基础上,采用Annexin V/PI双染色法检测经不同浓度Ru1处理后,SGC-7901细胞的凋亡情况。钌配合物对SGC-7901细胞DNA损伤相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响在探讨Ru1引起SGC-7901细胞周期阻滞及DNA损伤基础上,采用western blot技术检测经不同浓度Ru1处理后细胞DNA损伤相关蛋白表达的影响,包括ATR和phospho-ATR、H2AX和γH2AX、p53和phospho-p53、ERK1/2和P-ERK1/2、Bcl-2和Bax。通过检测细胞DNA相关蛋白的表达变化情况,研究Ru1抑制SGC-7901细胞增殖的相关通路机制。结果1.钌配合物对肿瘤细胞增殖抑制作用MTT实验结果揭示,Ru1对体外培养的三种肿瘤细胞(SGC-7901、Hela与MDA-MB-231细胞)均表现较强的增殖抑制作用,抑制率具有浓度依赖性,且Ru1对SGC-7901细胞抑制增殖效果最佳,IC50值为26.5μM。结晶紫染色实验所得结果也说明Ru1可抑制SGC-7901细胞增殖,与MTT结论相吻合。通过筛选比较后选择SGC-7901细胞以作后续试验研究。Ru1对羊水细胞的作用实验结果揭示Ru1对SGC-7901细胞的毒性作用要强于羊水细胞。2.肿瘤细胞对钌配合物的内吞作用根据内吞实验结果得知,钌配合物明亮红色荧光主要集中在细胞核区域,且随着配合物浓度的增加,红色荧光也呈现加强趋势。由此可说明,SGC-7901细胞能将Ru1吞入胞内,且Ru1主要集中分布在细胞核区域。3.钌配合物对SGC-7901细胞周期的影响周期实验数据表明,Ru1处理SGC-7901细胞24h后,SGC-7901细胞周期发生了改变。Ru1能显著阻滞SGC-7901细胞周期于G0/Gl期。4.钌配合物对SGC-7901细胞DNA的影响彗星实验结果说明,SGC-7901细胞经Ru1处理24后,与正常对照组相比,细胞尾部长度、彗星长、细胞尾矩、Olive尾矩均随浓度递增呈增加趋势,差异有显著意义(*P0.05,**P0.01),证明Ru1对SGC-7901细胞DNA有损伤作用。5.钌配合物对SGC-7901细胞凋亡的影响凋亡实验结果显示,Ru1作用于SGC-7901细胞24h后可导致SGC-7901细胞出现明显的凋亡,与正常对照组相比,Ru1处理组细胞凋亡率均呈显著性差异(*P0.05,**P0.01),而且这种致凋亡作用呈剂量依赖性。6.钌配合物对SGC-7901细胞DNA损伤相关蛋白及凋亡相关蛋白表达的影响Western blot结果揭示,Ru1可激活ATR,呈剂量依赖性增加phospho-ATR,p53,phospho-p53,phospho-ERK1/2及Bax蛋白的表达,同时下调Bcl-2蛋白的表达。结论1.钌多吡啶配合物(Ru1)对三种肿瘤细胞SGC-7001、Hela、MDA-MB-231细胞有增殖抑制作用,对SGC-7901细胞增殖抑制作用最明显。2.SGC-7901细胞将Ru1吞入胞内,且能将Ru1运输至细胞核区域。3.Ru1能抑制SGC-7901细胞增殖抑制过程,可使阻滞细胞周期于G0/Gl期,阻滞作用具有浓度依赖性。4.Ru1作用靶标为细胞DNA,可导致SGC-7901细胞DNA损伤断裂,同时可导致细胞发生凋亡,且这些作用具有浓度依赖性。。5.Ru1抑制SGC-7901肿瘤细胞的分子机制是诱导DNA损伤和激活细胞周期检验点,磷酸化系列细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白(phospho-ATR,p53,phospho-p53,phospho-ERK1/2,Bax和下调Bcl-2等发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。
【关键词】：钌配合物 增殖 细胞周期检验点 DNA损伤
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 摘要6-10
• ABSTRACT10-14
• 第一章 前言14-22
• 1.1 引言14-15
• 1.2 金属抗肿瘤药物的研究进展15-17
• 1.2.1 铂类金属抗肿瘤药15-16
• 1.2.2 钌金属配合物抗肿瘤药16-17
• 1.2.3 其他金属抗肿瘤药物17
• 1.3 细胞DNA损伤检控点17-19
• 1.4 研究内容与方法19-20
• 1.5 研究创新点20-21
• 1.6 研究的技术路线21-22
• 第二章 钌配合物对肿瘤细胞增殖的影响22-33
• 2.1 实验材料与仪器22-25
• 2.1.1 肿瘤细胞与药物22-23
• 2.1.2 试剂与耗材23
• 2.1.3 主要实验仪器设备23-24
• 2.1.4 主要试剂配制24-25
• 2.2 实验方法25-28
• 2.2.1 细胞复苏25-26
• 2.2.2 细胞培养26
• 2.2.3 细胞传代26
• 2.2.4 细胞冻存26
• 2.2.5 MTT实验检测钌配合物对肿瘤细胞的作用26-27
• 2.2.6 结晶紫染色实验检测细胞毒性27-28
• 2.2.7 钌配合物对羊水细胞的作用28
• 2.2.8 统计学处理28
• 2.3 结果28-31
• 2.3.1 钌配合物对肿瘤细胞SGC-7901、Hela、MDA-MB-231 的影响28-30
• 2.3.2 结晶紫染色结果30
• 2.3.3 钌配合物对羊水细胞的影响30-31
• 2.4 讨论31-33
• 第三章 SGC-7901 细胞对钌配合物的内吞作用33-37
• 3.1 实验材料与仪器33
• 3.1.1 肿瘤细胞与药物33
• 3.1.2 主要试剂33
• 3.1.3 主要实验仪器设备33
• 3.2 实验方法33-34
• 3.2.1 盖玻片处理33-34
• 3.2.2 细胞爬片34
• 3.2.3 加药处理34
• 3.2.4 细胞固定及DAPI染色34
• 3.3 结果34-35
• 3.3.1 SGC-7901 细胞对钌配合物的内吞情况34-35
• 3.4 讨论35-37
• 第四章 钌配合物对SGC-7901 细胞周期的影响37-41
• 4.1 实验材料与仪器37
• 4.1.1 肿瘤细胞与药物37
• 4.1.2 主要试剂37
• 4.1.3 主要实验仪器设备37
• 4.2 实验方法37-38
• 4.2.1 细胞接种、加药处理37-38
• 4.2.2 制备单细胞悬液38
• 4.2.3 乙醇固定细胞38
• 4.2.4 细胞染色38
• 4.2.5 统计分析38
• 4.3 结果38-40
• 4.3.1 钌配合物对SGC-7901 细胞的周期影响38-40
• 4.4.讨论40-41
• 第五章 钌配合物对SGC-7901 细胞DNA及凋亡的影响41-50
• 5.1 实验材料与仪器41-42
• 5.1.1 肿瘤细胞与药物41
• 5.1.2 主要试剂41-42
• 5.1.3 主要实验仪器设备42
• 5.2 彗星实验方法42-43
• 5.2.1 玻片的准备42
• 5.2.2 细胞接种、加药处理42
• 5.2.3 单细胞的制备42
• 5.2.4 胶体的制备42-43
• 5.2.5 细胞的裂解43
• 5.2.6 电泳43
• 5.2.7 中和与染色43
• 5.2.8 彗星图分析43
• 5.3 细胞凋亡实验方法43-44
• 5.3.1 细胞接种、加药处理43-44
• 5.3.2 制备单细胞悬液44
• 5.3.3 细胞染色44
• 5.3.4 统计分析44
• 5.4 结果44-47
• 5.4.1 钌配合物对SGC-7901 细胞DNA的损伤作用44-45
• 5.4.2 钌配合物对SGC-7901 细胞凋亡的损伤作用45-47
• 5.5 讨论47-50
• 第六章 钌配合物对SGC-7901 细胞DNA损伤相关蛋白表达的影响50-62
• 6.1 实验材料与仪器50-53
• 6.1.1 肿瘤细胞与药物50
• 6.1.2 主要试剂50-51
• 6.1.3 主要实验仪器设备51
• 6.1.4 主要试剂配制51-53
• 6.2 实验方法53-57
• 6.2.1 细胞种板、加药处理53
• 6.2.2 细胞蛋白样品的制备53-54
• 6.2.3 标准蛋白曲线的绘制54-55
• 6.2.4 测定细胞蛋白质含量55
• 6.2.5 Western Blot55-57
• 6.3 结果57-60
• 6.3.1 钌配合物对SGC-7901 细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白表达的影响57-60
• 6.4 讨论60-62
• 总结与展望62-63
• 参考文献63-68
• 附录68-69
• 致谢69

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