紫草素逆转NSCLC的EGFR-TKI耐药及靶向紫草素纳米颗粒的初步制备

发布时间：2017-08-29 09:23

  本文关键词：紫草素逆转NSCLC的EGFR-TKI耐药及靶向紫草素纳米颗粒的初步制备

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【摘要】：目的:EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药,导致EGFR敏感突变患者治疗失败甚至死亡,严重影响了人类健康和生命,EGFR-TKI耐药机制复杂,克服耐药成为该领域研究的热点和难点。为克服EGFR-TKI耐药,本实验拟观察紫草素逆转EGFR-TKI耐药NSCLC细胞株的作用及其可能机理;尝试构建EGFR单链抗体(简称scFv)介导的紫草素纳米颗粒。方法:1、紫草素不同浓度作用EGFR-TKI耐药肺腺癌H1975细胞(20号外显子T790M突变以及21号外显子L858R突变),MTT实验观察紫草素作用24 h、48 h和72 h对肺腺癌细胞增殖的影响,相差显微镜下观察细胞形态、流式细胞术检测细胞凋亡和周期,Western blot检测细胞中EGFR信号通路下游关键分子EGFR、AKT、ERK表达及磷酸化水平,Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2表达以及DNA修复酶PARP的变化。2、低浓度(1.25μM)紫草素联合一代EGFR-TKI(吉非替尼/盐酸埃克替尼)共同作用于EGFR继发耐药细胞株,通过MTT法、克隆形成实验、流式细胞术和Western blot法观察细胞增殖、凋亡以及EGFR、AKT、ERK表达及磷酸化水平。3、采用单乳化容剂蒸发法合成高分子聚合物PLGA-PEG负载的紫草素和超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SIONPs),之后与单链抗体偶联;通过透射电镜、激光粒度仪、免疫荧光镜检测载药纳米颗粒形态、粒径、电荷以及细胞内化情况。结果:1、紫草素能够抑制H1975细胞增殖,该抑制作用呈浓度和时间依赖性,紫草素浓度为10μM时,耐药细胞抑制率达到70%;流式细胞术显示紫草素诱导H1975细胞发生凋亡,紫草素浓度为10μM时,凋亡率达到70%;细胞周期分析发现紫草素阻滞细胞于S期,EGFR、AKT和ERK蛋白表达下降,p-EGFR、p-AKT和p-ERK磷酸化水平降低,凋亡相关蛋白Bcl-2表达减少,PARP发生剪切。2、紫草素联合EGFR-TKI,增加细胞抑制,促使细胞死亡;EGFR、AKT和ERK蛋白表达无明显变化,但是p-EGFR、p-AKT和p-ERK磷酸化水平却降低。3、构建的抗EGFR单链抗体-紫草素纳米颗粒(scFv-SHK-SIONPs),表观特征分析显示纳米颗粒呈球形,多分散指数(PI)为0.058,粒度大小均一,粒径为173.3 nM,Zeta电荷-28.55 mV,荧光显微镜下显示H1975细胞内高效摄取scFv-SHK-SIONPs。结论:1、紫草素能够抑制EGFR-TKI耐药肺癌细胞株增殖,诱导其凋亡,机制可能与下调EGFR、AKT和ERK的表达及其磷酸化水平有关,与降低凋亡相关蛋白Bcl-2表达和促使PARP发生剪切有关。2、紫草素恢复了肺腺癌耐药细胞株对EGFR-TKI的敏感性。3、成功构建scFv-SHK-SIONPs,表征分析符合实验要求,肿瘤细胞能够主动摄取scFv-SHK-SIONPs进入胞内。
【关键词】：非小细胞肺癌 EGFR-TKI耐药 靶向治疗 紫草素 纳米药物载体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-12
• 文献回顾12-20
• 第一部分 紫草素对EGFR-TKI耐药NSCLC作用的实验研究20-30
• 1 材料20-22
• 2 方法22-26
• 3 结果26-29
• 4 讨论29-30
• 第二部分 紫草素逆转NSCLC的EGFR-TKI耐药的实验研究30-43
• 1 材料30-32
• 2 方法32-35
• 3 结果35-41
• 4 讨论41-43
• 第三部分 抗EGFR单链抗体紫草素纳米颗粒的初步构建43-50
• 1 材料43-44
• 2 方法44-46
• 3 结果46-47
• 4 讨论47-50
• 小结50-51
• 参考文献51-58
• 个人简历和研究成果58-59
• 致谢59

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本文编号：752526