Pokemon对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

发布时间：2017-08-30 07:28

  本文关键词：Pokemon对乳腺癌MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

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【摘要】：目的:1.构建表达pokemon基因的慢病毒载体,建立稳定性表达pokemon基因的乳腺癌MCF-7细胞系,并分别观察pokemon的高表达对MCF-7细胞侵袭和迁移能力的影响。2.探讨乳腺癌组织中pokemon蛋白的表达及意义。方法:实验分为两部分:第一部分通过RT-PCT方法获得pokemon-c DNA,将pokemon-c DNA与GV-165载体连接,得到带有目的基因慢病毒表达载体,再将三种质粒(GV165/Pokemon、p Helper 1.0、p Helper 2.0)共转染293T细胞,包装得到病毒载体原液并测定其滴度。将得到的高滴度pokemon表达病毒载体(pokemon组)和空白病毒载体(NC组)分别转染MCF-7细胞,建立稳定高表达pokemon的乳腺癌MCF-7细胞系。通过荧光显微镜观察Pokemon表达慢病毒载体的转染效率,Western blot检测GFP-Pokemon融合蛋白的表达能力,Transwell试验及细胞划痕实验检测pokemon基因高表达对MCF-7细胞侵袭迁移能力的作用。第二部分利用免疫组织化学方法(IHC)检测185例乳腺癌及23例边缘组织组合芯片中pokemon基因的表达情况,并且分析pokemon的高表达和乳腺癌的发病年龄、肿瘤组织类型、淋巴结转移以及细胞核分级等临床病理指标之间的相关性。结果:第一部分:1.成功构建含有pokemon基因的慢病毒载体:1)通过RT-PCR方法获得目的基因,将pokemon-c DNA和慢病毒载体表达质粒GV-165经过酶切、连接、转化后,得到GV165-pokemon重组载体,以上结果均经过酶切及测序鉴定,与预期结果相符。2)将病毒载体三质粒系统(Pokemon-GV165重组载体、p Helper 1.0与p Helper2.0)共转染293T细胞48h后,离心后收集上清液,过滤器过滤后得到病毒浓缩液。3)将病毒稀释后转染293T细胞24h后,通过RT-PCR测定所收集的病毒滴度为2.0×108 TU/m L。2.成功建立稳定高表达pokemon的MCF-7细胞系:1)在pokemon表达病毒载体和空白病毒载体(NC)转染MCF-7细胞48小时后,在荧光显微镜下两组细胞均可见GFP蛋白表达(绿色荧光)。2)pokemon转染组GFP及融合蛋白的表达主要集中于细胞核,而空白病毒转染组其表达主要分布于细胞质。3)Western blot显示在pokemon转染组中6号克隆具有pokemon-GFP融合蛋白的表达,而空白病毒转染组只有GFP蛋白表达。3.Transwell实验结果显示pokemon组比NC组到达Transwell小室下室的细胞数目明显减少,差异具有统计学意义(P0.05),说明pokemon可抑制MCF-7细胞的侵袭能力。4.划痕实验结果提示pokemon组比NC组经过8h、32h后细胞迁移的距离无明显变化,表明pokemon基因对MCF-7细胞迁移能力无明显影响。第二部分:1.pokemon蛋白在乳腺癌中的表达高于癌旁正常乳腺组织(P0.05)。2.pokemon蛋白高表达和乳腺癌组织类型相关,其在乳腺导管癌中的表达高于乳腺小叶癌(P0.05),但和发病年龄、有无淋巴结转移、细胞核分级无关(P0.05)。结论:1.pokemon可抑制乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力2.pokemon蛋白在乳腺癌组织中存在高表达,其在乳腺导管癌中的表达高于乳腺小叶癌
【关键词】：pokemon 慢病毒载体 MCF-7细胞 细胞侵袭能力
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 主要缩略词及英文索引12-13
• 前言13-15
• 第一部分 实验内容15-29
• 1.材料与方法15-23
• 2.实验结果23-29
• 第二部分 乳腺癌中Pokemon的表达及与临床病理的关系29-35
• 1.材料与方法29-31
• 2.实验结果31-35
• 讨论35-39
• 结论39-41
• 参考文献41-45
• 综述45-57
• 参考文献53-57
• 附录57-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Xinkai Zhao;Qiaoming Ning;Xiaoning Sun;De'an Tian;;Pokemon reduces Bcl-2 expression through NF-κ Bp65:a possible mechanism of hepatocellular carcinoma[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2011年06期

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本文编号：758001