microRNA-639通过靶定ZEB1抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力

发布时间：2017-08-30 20:29

  本文关键词：microRNA-639通过靶定ZEB1抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力

  更多相关文章： miR-639 肝细胞癌 ZEB1 迁移 侵袭 EMT

【摘要】：目的:肝癌是最为常见的原发性肿瘤之一,其发病率在恶性肿瘤中排名第五位,病死率排名第二。随着肝癌病程的发展,其癌细胞易发生转移,是肝癌难以治愈的,死亡率高的主要原因。肝癌的发生、发展与许多因素密切相关,涉及细胞内多种基因表达的改变。micro RNA(mi RNA)是内源性非编码小RNA分子,能与m RNA的非编码序列互补,介导m RNA的降解或抑制其翻译,是细胞内重要的转录后调控机制。已有研究表明mi RNA与肝癌的发生发展密切相关。本实验室前期工作证实,micro RNA-639(mi R-639)在肝癌中表达下调,并且抑制肝癌细胞的生长和增殖,在肝癌中发挥抑癌基因的功能。本课题进一步探讨mi R-639对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,筛选其下游直接靶基因,探索mi R-639在肝癌细胞中发挥抑癌基因的生物学机制。并且结合mi R-639和其靶基因ZEB1的功能与肿瘤细胞发生迁移和侵袭的生物学过程,深入探讨了mi R-639调控肝癌细胞迁移和侵袭能力的具体分子生物机制,以及可能的调控途径。力求为研究肝癌转移的调控机制提供理论依据。方法:1.利用Transwell小室以及matrigel模拟细胞基底膜,采用Transwell迁移和侵袭实验验证mi R-639对肝癌细胞系QGY-7703和Hep G2迁移和侵袭能力的影响。2.利用mi RBase Targets、Target Scan和Pic Tar等软件,筛选mi R-639的靶基因,最终我们选择ZEB1作为研究对象。3.设计并构建带有ZEB1 3’UTR的EGFP报告载体,利用荧光报告载体实验验证mi R-639与ZEB1的靶定关系,并结合q RT-PCR和Western blot实验技术从m RNA水平和蛋白质水平验证了mi R-639对ZEB1调控关系。4.研究靶基因的功能,我们构建了ZEB1的过表达和敲降质粒,并通过Transwell迁移和侵袭实验确证ZEB1能够促进肝癌细胞QGY-7703和Hep G2细胞的迁移和侵袭能力。然后我们通过对肝癌细胞迁移和侵袭的挽救实验,验证mi R-639是否通过直接调控靶基因ZEB1发挥对肝癌细胞迁移和侵袭的调控作用。5.最后,我们利用Western blot技术检测了mi R-639和ZEB1对肝癌细胞EMT转化途径的蛋白标志物E-cadherin、Vimentin和ICAM-1的影响,探索mi R-639是否通过靶定ZEB1调控EMT途径。结果:过表达mi R-639抑制肝癌细胞QGY-7703和Hep G2的迁移和侵袭能力。生物信息学方法预测mi R-639能够靶定ZEB1基因m RNA的3’UTR区域,荧光报告载体实验确证mi R-639直接靶定ZEB1,并且能够从m RNA水平和蛋白质水平负调控ZEB1的表达。mi R-639与靶基因的挽救实验进一步验证了mi R-639对肝癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用是通过负调控靶基因ZEB1实现的。Western blot结果表明mi R-639能够上调E-cadherin的表达,下调Vimentin和ICAM-1的表达,抑制肝癌细胞发生EMT转化,与其靶基因ZEB1对EMT途径的作用相反。结论:本实验研究并证实了mi R-639通过负调控ZEB1基因来抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,并且mi R-639对ZEB1基因的负调控作用,减弱了ZEB1基因对肝癌细胞EMT转化的促进,最终mi R-639在肝癌细胞中表现为抑癌基因的功能。
【关键词】：miR-639 肝细胞癌 ZEB1 迁移 侵袭 EMT
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语10-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、miR-639在肝癌细胞中的作用研究16-29
• 1.1 材料和方法16-23
• 1.1.1 实验材料16-17
• 1.1.2 实验方法17-23
• 1.1.3 统计方法23
• 1.2 结果23-28
• 1.2.1 pri-miR-639和Antago-miR-639质粒有效性的验证23-24
• 1.2.2 miR-639对肝癌细胞迁移能力的影响24-25
• 1.2.3 miR-639对肝癌细胞侵袭能力的影响25-26
• 1.2.4 pAntago-miR-639对肝癌细胞迁移能力的影响26-27
• 1.2.5 pAntago-miR-639对肝癌细胞侵袭能力的影响27-28
• 1.3 小结28-29
• 二、miR-639与ZEB1的靶定关系29-41
• 2.1 材料和方法29-36
• 2.1.1 实验材料29
• 2.1.2 实验方法29-36
• 2.1.3 统计学方法36
• 2.2 结果36-40
• 2.2.1 miR-639候选靶基因的筛选36-37
• 2.2.2 验证ZEB1是miR-639的直接靶基因37-38
• 2.2.3 验证miR-639对ZEB1mRNA表达水平的影响38-39
• 2.2.4 验证miR-639对ZEB1蛋白表达水平的影响39-40
• 2.3 小结40-41
• 三、ZEB1在肝癌细胞中的作用研究41-51
• 3.1 材料和方法41-46
• 3.1.1 实验材料41
• 3.1.2 实验方法41-46
• 3.1.3 统计学方法46
• 3.2 结果46-50
• 3.2.1 从mRNA表达水平检测ZEB1过表达和敲降质粒的有效性46-47
• 3.2.2 从蛋白质表达水平检测ZEB1过表达和敲降质粒的有效性47
• 3.2.3 ZEB1对肝癌细胞迁移能力的影响47-48
• 3.2.4 ZEB1对肝癌细胞侵袭能力的影响48-49
• 3.2.5 miR-639与ZEB1对肝癌细胞迁移和侵袭能力的挽救实验49-50
• 3.3 小结50-51
• 四、miR-639通过EMT途径影响肝癌细胞的迁移和侵袭能力51-56
• 4.1 材料和方法51-52
• 4.1.1 实验材料51
• 4.1.2 实验方法51-52
• 4.1.3 统计学方法52
• 4.2 结果52-55
• 4.2.1 ZEB1对EMT途径影响52-53
• 4.2.2 miR-639对EMT途径影响53-55
• 4.3 小结55-56
• 讨论56-59
• 全文结论59-60
• 参考文献60-64
• 发表论文和参加科研情况说明64-65
• 综述 非编码小RNA与肝癌65-78
• 综述参考文献73-78
• 致谢78

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本文编号：761321