STIP介导非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制研究

发布时间：2017-08-31 15:49

  本文关键词：STIP介导非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制研究

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【摘要】：肺癌是临床最常见的肺原发性恶性肿瘤,其病理类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC约占肺癌总数的80%-85%。在我国肺癌是导致恶性肿瘤病人死亡的首位原因,5年生存率仅有10%,其治疗方式以手术为主,但80%的患者确诊时已处于晚期,已失去了手术治疗机会。化疗是晚期肺癌主要治疗方法之一,但随着化疗次数增多,耐药率会越来越高。目前,晚期肺癌尚无理想治疗的方法,因此,深入研究肺癌的发病机制,寻找基于病因学的潜在分子靶点,对肺癌的诊断以及防治具有重要意义。STIP蛋白是含有多个结构域的核蛋白,在核中可以自我聚集,形成rod样的结构-stiposome。在C.elegans中,利用RNAi技术敲除STIP蛋白的表达,可以使线虫的早期胚胎发育停滞于16细胞阶段,通过导入人或果蝇的stip基因可以拯救由于STIP缺失而引起的致死表型,这表明STIP在物种进化的各阶段拥有重要的保守功能。蛋白质组的研究发现STIP是核剪接体(spliceosome)的组成成员,可能参与m RNA前体中内含子的移除过程,影响细胞内基因的表达调控。然而,至今关于其在肿瘤中的表达及功能尚未有报道。本课题研究发现,与肺癌旁组织相比,STIP在NSCLC组织中显著高表达并具有统计学意义,表明STIP的表达可能与NSCLC有关。为了明确STIP在NSCLC中的生物学功能,我们构建了靶向stip基因的sh RNA慢病毒,通过MTT实验和克隆形成以及体内裸鼠成瘤实验发现,下调STIP的表达能够显著抑制NSCLC细胞系A549和H460肿瘤细胞的增殖,并且抑制NSCLC移植瘤的生长,表明STIP具有促进NSCLC细胞增殖的功能。由于细胞增殖是通过细胞周期的有序运行实现的,因此,我们进一步探究了STIP对细胞周期的影响。在A549和H460细胞中干扰STIP表达后发现细胞周期阻滞于G2/M期。检测相关调控分子的表达,发现Cyclin B1、CDK1和Cdc25C蛋白表达减少,CDK1的Thr-14/Tyr-15位点的去磷酸化被抑制。推测其机制可能是通过抑制Cyclin B1-CDK1复合物的表达及活性而导致G2/M期的阻滞。细胞周期的阻滞常伴随着细胞凋亡的诱导,为了明确STIP对细胞凋亡的影响,我们干扰A549和H460细胞中STIP表达后检测这些细胞的核形态和膜磷脂酰丝氨酸外翻的变化,发现下调STIP表达能诱导NSCLC细胞发生凋亡,其诱导的机制:一方面是通过上调促凋亡蛋白Bax以及下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达;另一方面是通过增强Caspase-9和Caspase-3的活性,诱导程序性细胞死亡。有研究表明STIP作为剪接体的组成成员,参与m RNA前体中内含子移除过程,介导基因的转录。通过转录组测序分析,我们发现在A549细胞中干扰STIP表达,同对照组相比实验组有566个表达差异基因,其中490个上调和76个下调。这些基因影响多条与肿瘤相关的信号转导通路,包括MAPK、Wnt、PI3K/AKT和NF-kB信号通路。本研究对STIP在NSCLC中的生物学功能及其相关的分子调控机制进行揭示,表明STIP可能是NSCLC中一个潜在的诊断和治疗靶标。
【关键词】：非小细胞肺癌 STIP蛋白 细胞周期 细胞凋亡
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文缩写对照9-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 STIP蛋白的概述13-14
• 1.2 肺癌14-15
• 1.3 细胞增殖与肿瘤的关系15
• 1.4 细胞周期与肿瘤15-17
• 1.4.1 CDK-Cyclin16
• 1.4.2 CKIs16-17
• 1.4.3 细胞周期调控分子异常表达与肿瘤17
• 1.5 细胞凋亡与肿瘤17-19
• 1.5.1 细胞凋亡17-18
• 1.5.2 细胞凋亡的机制18-19
• 1.5.3 细胞凋亡与肿瘤19
• 1.6 本课题的研究目的、内容和意义19-21
• 第2章 STIP在肺癌组织中的表达情况及对肺癌细胞增殖的影响21-35
• 2.1 前言21
• 2.2 实验材料与实验仪器21-22
• 2.2.1 实验材料21-22
• 2.2.2 实验仪器22
• 2.3 实验方法22-31
• 2.3.1 试剂配制22-23
• 2.3.2 免疫组化23-24
• 2.3.3 细胞培养24-25
• 2.3.4 蛋白质的检测25-26
• 2.3.5 特异性STIP-sh RNA的制备26-29
• 2.3.6 慢病毒侵染构建稳定细胞系29-30
• 2.3.7 慢病毒侵染30
• 2.3.8 siRNA转染30-31
• 2.3.9 细胞增殖实验31
• 2.3.10 统计学分析31
• 2.4 实验结果31-34
• 2.4.1 STIP蛋白在肺癌组织中的表达31-32
• 2.4.2 干扰STIP表达抑制NSCLC细胞的增殖32-34
• 2.5 小结与讨论34-35
• 第3章 STIP对非小细胞肺癌细胞周期和凋亡的影响35-47
• 3.1 前言35-36
• 3.2 实验材料与实验仪器36
• 3.2.1 实验材料36
• 3.2.2 实验仪器36
• 3.3 实验方法36-39
• 3.3.1 试剂配制36
• 3.3.2 流式细胞术检测细胞周期36-37
• 3.3.3 细胞凋亡的检测37
• 3.3.4 Caspase酶活检测37-38
• 3.3.5 统计学分析38-39
• 3.4 实验结果39-44
• 3.4.1 干扰STIP表达对NSCLC细胞周期的影响39-40
• 3.4.2 干扰STIP的表达对G2/M期的相关分子的影响40
• 3.4.3 干扰STIP的表达对NSCLC细胞凋亡的影响40-43
• 3.4.4 干扰STIP的表达对凋亡相关分子及Caspases活性的影响43-44
• 3.5 小结与讨论44-47
• 第4章 下调STIP对人非小肺癌细胞转录组的影响47-56
• 4.1 前言47-48
• 4.2 实验材料与实验仪器48
• 4.2.1 实验材料48
• 4.2.2 实验仪器48
• 4.3 实验方法48-53
• 4.3.1 转录组测序48-50
• 4.3.2 Real-time PCR50-53
• 4.4 实验结果53-55
• 4.4.1 STIP干扰后NSCLC细胞基因表达谱的分析53-54
• 4.4.2 Real-time PCR54-55
• 4.5 小结与讨论55-56
• 第5章 STIP对裸鼠人非小细胞肺癌移植瘤生长的影响56-60
• 5.1 前言56
• 5.2 实验材料与实验仪器56
• 5.2.1 实验材料56
• 5.2.2 实验仪器56
• 5.3 实验方法56-58
• 5.3.1 裸鼠肺癌模型的建立56-57
• 5.3.2 肿瘤组织HE染色57-58
• 5.4 实验结果58-59
• 5.4.1 干扰STIP抑制NSCLC移植瘤生长58
• 5.4.2 HE染色结果58-59
• 5.5 小结与讨论59-60
• 结论与展望60-61
• 1 结论60
• 2 展望60-61
• 参考文献61-68
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录68-69
• 致谢69

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