小白菊内酯增强人肺腺癌A549细胞对顺铂敏感性的实验研究

发布时间：2017-09-01 05:07

  本文关键词：小白菊内酯增强人肺腺癌A549细胞对顺铂敏感性的实验研究

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【摘要】：目的:肺恶性肿瘤无论是发病率还是致死率都居高不下,传统化学疗法通常作为晚期肺恶性肿瘤的主要治疗手段,然后化疗会随着治疗的推移而产生耐药,且常常伴有多次化疗后累积的毒副反应,因此寻找能够增强化疗药物敏感性的新药,这对于减少化疗药物的使用剂量从而降低化疗药物的毒副反应具有重要的临床价值。本实验研究将从分子生物学水平,评价小白菊内酯是否具有增强肺腺癌A549细胞对顺铂的敏感性,评价小白菊内酯联合顺铂对人肺腺癌A549细胞的协同增敏作用。方法:选取对数增长期人肺腺癌A549细胞经不同剂量小白菊内酯和(或)顺铂后,以MTT法检测各组A549细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡,通过q值的比较得出二者是否具有协同抑制增殖、诱导凋亡作用;通过流式细胞术检测各组细胞周期情况及RT-PCR法检测凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡基因Bax的mRNA表达情况,探讨小白菊内酯增敏顺铂的可能机制。结果:MTT结果显示:小白菊内酯浓度在10μmol/L以下,具有促进A549细胞增殖作用,小白菊内酯浓度高于10μmol/L具有抑制人肺腺癌A549细胞增殖的作用;大剂量(20μmol/L)小白菊内酯与顺铂联用能够明显抑制人肺腺癌A549细胞的增殖(P0.05),通过q值计算,结果显示二药联用与小白菊内酯及顺铂单用相比有明显的协同抑制A549细胞增殖作用。FCM方法检测结果显示:大剂量(20μmol/l)小白菊内酯与顺铂联用,共同作用于人肺腺癌A549细胞,相比于小白菊内酯及顺铂单用组,二药联合组人肺腺癌A549细胞凋亡率为24.42%(早期凋亡与晚期凋亡细胞数,P0.05)较对照组明显增加且二药联用组G1+S期细胞比例增加(P0.05),通过q值计算比较,提示大剂量小白菊内酯与顺铂联用具有协同诱导A549细胞凋亡作用。RT-PCR法显示:大剂量小白菊内酯和顺铂联合与小白菊内酯及顺铂单用相比可明显下调联合干预组A549细胞的Bcl-2 mRNA的表达,上调Bax mRNA的表达(P0.05)。结论:大剂量小白菊内酯具有抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导其凋亡的作用,且小白菊内酯可增强人肺腺癌A549细胞对顺铂敏感性,二药联用对人肺腺癌A549细胞具有协同抑制增殖、诱导凋亡作用,其作用机制可能与阻滞细胞周期、下调Bcl-2mRNA、上调Bax mRNA的表达有关。
【关键词】：A549细胞 肺癌 顺铂 小白菊内酯 协同作用
【学位授予单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-8
• 英文缩略词表8-9
• 前言9-11
• 1、实验材料11-14
• 1.1 实验细胞11
• 1.2 实验试剂11
• 1.3 实验仪器11-12
• 1.4 主要实验试剂的配制12-14
• 1.4.1 小白菊内酯原液的配制12
• 1.4.2 PBS缓冲液的配制12
• 1.4.3 青、链霉素的配制12-13
• 1.4.4 DMEM低糖培养基的配制13
• 1.4.5 DMEM完全培养基的配制13
• 1.4.6 胰蛋白酶的配制13
• 1.4.7 MTT的配制13
• 1.4.8 SDS的配制13
• 1.4.9 MRNA引物的配制13-14
• 2、实验方法14-19
• 2.1 细胞准备14
• 2.1.1 细胞培养14
• 2.1.2 细胞计数14
• 2.2 MTT法筛选PTL及DDP对A549细胞的增殖抑制作用的药物浓度14-15
• 2.2.1 MTT法原理14
• 2.2.2 实验分组14-15
• 2.2.3 实验步骤15
• 2.3 MTT法检测低、中、高浓度PTL联合DDP对A549细胞的增殖抑制作用15
• 2.3.1 实验分组15
• 2.3.2 实验步骤15
• 2.4 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布15-17
• 2.4.1 细胞凋亡实验原理15-16
• 2.4.2 细胞周期检测原理16
• 2.4.3 实验分组16
• 2.4.4 实验步骤16-17
• 2.5 RT-PCR法测定BCL-2 和BAX的MRNA表达情况17-19
• 2.5.1 试验原理17
• 2.5.2 实验分组17
• 2.5.3 细胞培养17
• 2.5.4 总RNA提取17-18
• 2.5.5 RNA纯度测定18
• 2.5.6 RNA浓度测定18
• 2.5.7 RNA的反转录18-19
• 2.5.8 REAL TIME PCR19
• 3、统计学分析19-20
• 4、实验结果20-26
• 4.1 人肺腺癌A549细胞生长曲线及正常形态20-21
• 4.2 人肺腺癌A549细胞凋亡情况21
• 4.3 DDP及PTL作用于人肺腺癌A549细胞的有效浓度21-23
• 4.4 PTL联合DDP对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用23-24
• 4.5 流式细胞术检测PTL联合DDP对A549细胞的影响24-25
• 4.6 实时荧光定量PCR结果25-26
• 5、讨论26-33
• 5.1 小白菊内酯联合顺铂对人肺腺癌A549细胞的抗增殖作用26-30
• 5.1.1 细胞增殖26-27
• 5.1.2 小白菊内酯有效浓度的筛选27-28
• 5.1.3 顺铂有效干预浓度的选取28
• 5.1.4 PTL联合DDP对A549细胞的增殖抑制作用28-29
• 5.1.5 PTL联合DDP对A549细胞细胞周期的影响29-30
• 5.2 小白菊内酯联合顺铂对人肺腺癌A549细胞的凋亡诱导作用30-32
• 5.2.1 流式细胞术检测细胞凋亡30-31
• 5.2.2 凋亡抑制基因BCL-2 及凋亡基因BAX31-32
• 5.3 小白菊内酯与氧化应激32-33
• 6、结语33-34
• 6.1 结论33
• 6.2 研究结果的意义33-34
• 6.3 问题与展望34
• 7、参考文献34-37
• 8、附录37-44
• 8.1 公式37
• 8.1.1 协同计算公式37
• 8.1.2 细胞活力计算公式37
• 8.1.3 细胞抑制率计算公式37
• 8.2 各MRNA引物参数37
• 8.3 流式细胞术门框图37-38
• 8.3.1 细胞周期门框图37-38
• 8.3.2 细胞凋亡门框图38
• 8.4 PCR溶解曲线图38-39
• 8.5 IC_(50)统计结果39-41
• 8.6 性关性分析结果41-42
• 8.7 实验剪影42-44
• 文献综述44-57
• 参考文献53-57
• 致谢57-59
• 在学期间主要研究成果59

【参考文献】

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本文编号：770099