Procaspase-8靶向肿瘤特异性药物筛选稳定细胞系的构建

发布时间：2017-09-01 21:29

  本文关键词：Procaspase-8靶向肿瘤特异性药物筛选稳定细胞系的构建

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【摘要】：肿瘤的发生是一种复杂无序的过程,其发生机理和原因多种多样,有先天遗传因素,也有后天外界因素。正是由于它的复杂多变,致使癌症仍然至今仍是世界医学界的一个难题。随着人类医学水平的不断进步,越来越多的方法手段被应用到了癌症的治疗中。癌症传统治疗方式的缺点与不足,使生物靶点治疗成为了新一代研究的热点。TRAIL(Tumor necrosis factot-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)是TNF-α相关的细胞因子家族成员,由于其对正常细胞无伤害和对肿瘤细胞选择性诱导凋亡,使TRAIL成为肿瘤治疗的潜力药物。然而TRAIL的生产成本及其保存运输所需的花费开销十分巨大,因此开发TRAIL类似活性的小分子化合物是非常必要的。天然产物是一个很大的化合物库,但是如何从海量的天然产物中找到TRAIL的功能类似物仍是一个难题。由美国Canon创立的一种分子荧光标记技术配体-受体-募集物复合体荧光成像REFI给这一难题带来福音,用绿色荧光蛋白GFP标记β-Arresting检测G蛋白偶联受体的活化。同样我们可以利用该技术根据配体-受体-募集物复合体荧光成像技术的成功思路,来标记细胞中TRAIL引发凋亡通路中的蛋白Procaspase-8,若加入的天然提取物在细胞中能引起与加入TRAIL时相同的变化,则该提取物中可能存在与TRAIL有类似功能的替代物。因此,以该靶点构建筛药平台的稳定细胞系成为这一方法的关键所在。云南动植物资源丰富,是天然的药物资源库,该方法为TRAIL替代物的发现筛选提供了可靠的工具。为了避免Procaspase-8的过表达导致细胞凋亡,且同时能使用分子荧光标记技术筛选药物,将Procaspase-8后面的募集信号凋亡的蛋白区域去掉,只选择与FADD结合的区域Procase-8DED 1(1-84)(Prc8DED 1)的前84个氨基酸组成的小肽,如此既避免了转染细胞的凋亡,同时也能通过GFP荧光观测prc8DED 1的荧光募集变化。该细胞模型目前已初步构建成功。本实验的任务是摸清加入阳性药物后细胞的反应变化,及加入药物的最佳时间和浓度；以及利用第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9技术进一步敲除内源性Procaspase-8,以达到排除内源性Procaspase-8竞争结合DR4.DR5,优化已构建的筛选细胞模型的目的。实验内容与结果：1、利用分子生物学手段成功构建出细胞系U20S-Prc8DED1-GFP,将细胞消化悬浮后种入96孔L板中,设置浓度梯度和时间梯度,确定已构建细胞系U20S-Prc8DED1-GFP的正确性以及对药物TRAIL的敏感程度条件。用药物TRAIL处理后,通过荧光显微镜观察发现,细胞绿色荧光开始发生凝聚,约30 min后,绿色荧光恢复原来舒展状态,说明该细胞系对药物TRAIL有应激性。2、为了进一步优化细胞系U20S-Prc8DED1-GFP,避免内源性Procaspase-8对细胞表面受体DR4/5的竞争性结合,利用第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9将内源性Procaspase-8敲除,针对目标靶序列设计构建Guide-RNA.Donor DNA,通过电转共转进细胞U20S-PrcDED 1-GFP当中,筛选出带有红光的单克隆细胞,并加药检测细胞；结论：已初步确认细胞系U20S-PrcDED 1-GFP对药物TRAIL有一定的应激性,CRISPR/Cas9敲除技术质粒已构建完备,目前正在转染检测细胞的过程当中。
【关键词】：Procaspase-8 细胞凋亡 CRISPR/Cas9 TRAIL
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 缩略表12-16
• 第一章 绪论16-26
• 1.1 Procaspase-8与DISC信号通路16-18
• 1.2 以TRAIL为激动剂的抗肿瘤靶向的药物筛选18-19
• 1.3 受体效应复合物荧光成像技术(REFI)19
• 1.4 U2OS-Prc8DED1-GFP的构建机制19-20
• 1.5 新的基因编辑技术--CRISPR/Cas920-22
• 1.6 CRISPR/Cas9的应用前景22
• 1.7 研究目的22-23
• 1.8 研究路线23-26
• 1.8.1 细胞系U2OS-Prc8DED1-GFP鉴定方法23
• 1.8.2 优化筛选细胞系U20S-Prc8DED1-GFP23-26
• 第二章 U2OS-Prc8DED1-GFP细胞系的验证26-58
• 2.1 实验材料及试剂配制27-38
• 2.1.1 载体、菌种及细胞27-28
• 2.1.2 实验仪器和耗材28-30
• 2.1.3 实验试剂和药品30-32
• 2.1.4 实验试剂的准备32-38
• 2.2 实验内容与结果38-58
• 2.2.1 细胞实验38-42
• 2.2.2 高内涵显微镜下拍摄观察42-45
• 2.2.3 图片结果分析45-48
• 2.2.4 查找影响因素,优化细胞系U2OS-Prc8DED1-GFP48-56
• 2.2.5 分析讨论56-58
• 第三章 内源性Procaspase-8的敲除58-92
• 3.1 实验思路及流程59-60
• 3.2 实验材料60
• 3.2.1 载体、菌种及细胞60
• 3.2.2 实验仪器和耗材60
• 3.2.3 实验试剂及药品60
• 3.2.4 实验试剂配制60
• 3.3 实验内容及结果分析60-92
• 3.3.1 质粒构建60-86
• 3.3.2 细胞转染86-90
• 3.3.3 单克隆细胞筛选90-91
• 3.3.4 药物验证91-92
• 第四章 讨论与总结92-94
• 参考文献94-106
• 致谢106-107
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录107

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本文编号：774415