Irx5过表达乳腺癌细胞株的构建及其细胞功能分析

发布时间：2017-09-02 00:26

  本文关键词：Irx5过表达乳腺癌细胞株的构建及其细胞功能分析

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【摘要】：Irx5(Iroquois homeobox gene family)基因是伊洛魁同源盒基因家族中的一员,该家族有6个成员。有报道表明Irx家族的一些成员与人多种肿瘤的发生有关,其中Irx1和Irx4已被证实分别是胃癌和前列腺癌转移的抑制基因;而Irx5基因在人、鼠高转移乳腺癌细胞系中均低表达,且其表达水平与乳腺癌患者癌细胞的转移潜力呈明显负相关,暗示Irx5可能是一个乳腺癌转移的抑制基因。为了进一步研究Irx5基因在乳腺癌细胞发生、发展及转移过程中的作用。我们构建了Irx5基因过表达MDA-MB-231乳腺癌细胞株,利用细胞增殖、迁移和侵袭等体外实验确认Irx5基因对乳腺癌细胞转移的抑制作用。研究结果如下:(1)根据GenBank中人Irx5基因序列(NM_005853),设计一对引物,采用RT-PCR从293T细胞的cDNA中成功扩增出Irx5基因的编码区序列;纯化后的RT-PCR产物经XbaI和BamHI双酶切后,与同样酶切线性化的慢病毒载体(PEB-3xflag-GP)连接,获得重组慢病毒表达质粒(PEB-3xflag-GP-Irx5);经酶切、电泳检测、测序后发现重组慢病毒表达质粒(PEB-3xflag-GP-Irx5)中的插入片段与GenBank中Irx5基因编码区序列完全一致,表明重组过表达质粒构建成功。(2)将成功构建的重组慢病毒质粒和包装质粒共转染293T细胞,生产重组慢病毒,病毒悬液梯度稀释法测得病毒滴度为3~8×108 TU/mL;用病毒感染高转移的人MDA-MB-231乳腺癌细胞。感染48 h后用2.5μg/m L嘌呤霉素筛选稳定过表达Irx5基因的细胞株,经2~3周的筛选,Western blotting法检测了Irx5基因在细胞中的表达情况。结果显示用重组慢病毒感染的乳腺癌细胞中有外源Irx5基因的过表达,而用空载体病毒感染(对照)的乳腺癌细胞中无外源Irx5基因的表达,说明已成功构建了Irx5基因过表达的乳腺癌细胞株,Irx5基因在乳腺癌细胞中可以稳定表达。(3)通过MTT、克隆形成、细胞划痕和Transwell实验研究了Irx5基因对乳腺癌细胞增殖、转移和侵润能力的影响。与对照细胞相比,MTT和克隆形成实验结果表明Irx5基因过表达的乳腺癌细胞增殖能力下降;细胞划痕和Transwell迁移实验中Irx5基因过表达的乳腺癌细胞迁移能力降低;Transwell侵袭实验中Irx5基因过表达的乳腺癌细胞侵袭能力降低;由此说明Irx5过表达抑制乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭。Irx5基因这一抑制作用的证实,不仅为进一步阐明其分子机制和转录调控的网络通路奠定了基础,而且为转移性乳腺癌的分子诊断、个体化治疗和靶向药物治疗等提供了一个新的思路。
【关键词】：Irx5基因 慢病毒载体 迁移 侵润 基因过表达
【学位授予单位】：淮北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-19
• 1.1 乳腺癌转移相关基因的研究进展11-19
• 1.1.1 乳腺癌转移促进基因12-14
• 1.1.2 乳腺癌转移抑制基因14-16
• 1.1.3 乳腺癌转移的分子机制16-19
• 第二章 Irx5过表达乳腺癌细胞株的构建19-39
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 载体和细胞19-20
• 2.1.2 仪器20
• 2.1.3 主要试剂20-21
• 2.2 方法21-33
• 2.2.1 Irx5过表达乳腺癌细胞株的筛选流程21
• 2.2.2 Irx5基因重组慢病毒载体构建21-27
• 2.2.3 慢病毒包装27-30
• 2.2.4 Irx5过表达乳腺癌细胞株的筛选30-33
• 2.3 结果与分析33-37
• 2.3.1 PCR扩增结果33
• 2.3.2 菌落PCR鉴定结果33-34
• 2.3.3 重组慢病毒载体阳性克隆双酶切结果34-35
• 2.3.4 阳性克隆测序结果35-36
• 2.3.5 慢病毒滴度测定36-37
• 2.3.6 Western blotting检测外源Irx5基因表达的结果37
• 2.4 小结37-38
• 2.5 讨论38-39
• 第三章 Irx5基因对乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响39-47
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 仪器39
• 3.1.2 主要试剂与耗材39-40
• 3.2 方法40-42
• 3.2.1 细胞培养及传代40
• 3.2.2 MTT法检测细胞增殖40
• 3.2.3 克隆形成实验40-41
• 3.2.4 细胞划痕实验41
• 3.2.5 Transwell细胞迁移实验41-42
• 3.2.6 Transwell细胞侵袭实验42
• 3.3 结果与分析42-45
• 3.3.1 MTT实验检测乳腺癌细胞的增殖42-43
• 3.3.2 克隆形成实验检测乳腺癌细胞的增殖43
• 3.3.3 细胞划痕实验检测乳腺癌细胞迁移能力43-44
• 3.3.4 Transwell实验检测乳腺癌细胞迁移能力44-45
• 3.3.5 Transwell实验检测乳腺癌细胞侵袭能力45
• 3.4 小结45-46
• 3.5 讨论46-47
• 总结47-48
• 参考文献48-57
• 攻读硕士学位期间出版或发表的论著、论文57-58
• 致谢58

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1 贺兰湘,张先林;家族性乳腺癌遗传易感基因研究现状[J];国外医学.遗传学分册;2000年05期

2 裴晓华,马秀t，

本文编号：775311