循环肿瘤细胞新型检测方法的建立及其在临床样本中的应用

发布时间：2017-09-02 02:38

  本文关键词：循环肿瘤细胞新型检测方法的建立及其在临床样本中的应用

  更多相关文章： 循环肿瘤细胞 端粒酶逆转录酶 单纯疱疹病毒 肿瘤 脑胶质瘤 CTCs 转移 基因表达

【摘要】：第一部分 循环肿瘤细胞新型检测方法的建立及其在临床样本中的验证循环肿瘤细胞在肿瘤早期诊断、个体化治疗/疗效评估及肿瘤转移机制研究等方面具有重要价值。然而由于其在人体循环系统中所占比例极低,循环肿瘤细胞的分离和鉴定成为临床应用的难点。oHSVl-hTERT-GFP是一种经过基因改造的人单纯疱疹病毒。我们将该病毒的复制关键基因ICP4的野生型启动子替换为人端粒酶逆转录酶的启动子,并在ICP4下游连接GFP表达盒,以使该病毒在感染细胞后,能在端粒酶逆转录酶转录环境的作用下激活下游绿色荧光蛋白的表达基因,进而实现对肿瘤细胞的示踪作用。本研究旨在利用该病毒捕获循环肿瘤细胞,从而建立一种简便、重复性好、灵敏度高的检测方法,并进一步对该检测方法的可靠性及临床应用价值进行探讨。在本研究中,我们首先对该方法是否能捕获循环肿瘤细胞进行验证,包括：利用Western blot技术检测肿瘤细胞系、肿瘤组织及正常细胞中端粒酶逆转录酶表达情况；该方法体外模拟回收率的测定；荧光显微镜观察病毒oHSVl--hTERT-GFP感染肿瘤细胞后GFP的时序表达情况；激光共聚焦技术验证该方法捕获肿瘤细胞的可靠性。结果显示,肿瘤细胞系及组织均不同程度表达端粒酶逆转录酶。该方法体外模拟回收率可达85%以上：外周血中加入SMMC7721细胞10,50,100(个)的检出数分别为6.8±2.04,42.8±4.04,87.8±7.03,总体检出率为90.1%,外周血中加入Huh7细胞10,50,100(个)的检出数分别为6.9±1.90,42.9±3.88,87.9±7.63,总体检出率为90.02%。线性回归分析显示该方法捕获的细胞数与实际肿瘤细胞数呈明显相关性,r20.95。此外不同肿瘤细胞系转染病毒24小时后均可稳定表达GFP蛋白,Confocal实验确实肺癌患者循环血中表达GFP蛋白的细胞为肿瘤细胞。以上结果说明该方法能够捕获循环血中的肿瘤细胞。随后我们针对该方法的临床检验效能进行评估：收集了肺癌外周血标本101例、肝癌患者外周血标本36例,将标本裂解去除红细胞后,按照MOI=1比例转染重组病毒oHSV1--hTERT-GFP DNA,37℃,5%CO2条件下培养24h,收集细胞,流式细胞仪检测CD45-/GFP+细胞并计数。临床标本检测结果显示100例正常人群中,真阴性率为97%(检出细胞数3个/4mL血),101例肺癌及36例肝癌中,真阳性率分别为79.2%、91.6%。病理学诊断为淋巴结转移的肺癌及肝癌患者中,CTCs的阳性率均大于80%(肺腺癌81.3%,肺鳞癌85.7%,肝癌95.7%),病理学诊断发生远处转移的病例中,CTCs检测的阳性率为100%。提示该方法具有良好的检测灵敏度及特异性。最后,我们在40例肺腺癌标本中比较了CellSearch方法和oHSV1--hTERT-GFP方法。结果显示,40例标本中oHSV1--hTERT-GFP法检测的阳性率(70%)高于CellSearch (40%),其中oHSV1--hTERT-GFP法检测为阴性的病例在CellSearch中检测结果仍为阴性。综上所述,本研究建立了一种新型循环肿瘤细胞检测方法,并对该方法的可靠性及临床应用价值进行了评估。该方法能够特异性示踪循环肿瘤细胞,具有潜在临床应用价值。第二部分oHSV1-hTERT-GFP法检测CTCs在脑胶质瘤中的临床应用脑胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤,占所有中枢神经系统肿瘤的40%-60%。具有高复发率、高死亡率及低治愈率的特点。胶质瘤生长迅速,具有很强的侵袭性。胶质瘤复发形式多样,但胶质瘤的复发具有原位复发和很少颅外转移的特点。本研究以初治脑胶质瘤患者外周血标本为研究对象,检测其循环肿瘤细胞,结合手术情况寻找胶质瘤是否发生颅外转移的事实证据。在本研究中,我们发现初治脑胶质瘤患者在手术前即可检测到循环肿瘤细胞,术前CTCs数目平均值为5±1个/4mL血,范围为0-20个/4mL血。说明血脑屏障并不能阻挡胶质瘤肿瘤细胞向循环血中播散。手术后第2天检测同一患者的外周血肿瘤细胞,平均值为2.4±3.4/4mL血,范围为0-15/4 mL血。高级别胶质瘤(WHOⅢ级或Ⅳ级)患者术后CTCs数目的减少较术前有显著性差异,p=0.0004。低级别胶质瘤(WHO Ⅰ级或Ⅱ级)术后CTCs数目较术前呈减少趋势。该结果提示手术对胶质瘤有一定的治疗效果,能够有效减少患者肿瘤负荷,此外术后CTCs数量有助于评估手术疗效。随后,我们对比分析脑胶质瘤患者及肺癌脑转移患者外周血白细胞基因表达水平。结果显示在脑胶质瘤样本中白细胞免疫相关基因表达上调。以上结果提示,血脑屏障不是阻挡脑胶质瘤细胞向颅外播散的原因,脑胶质瘤肿瘤细胞能够播散到外周循环。
【关键词】：循环肿瘤细胞 端粒酶逆转录酶 单纯疱疹病毒 肿瘤 脑胶质瘤 CTCs 转移 基因表达
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4
【目录】：

• 英文缩略词7-8
• 第一部分 循环肿瘤细胞新型检测方法的建立及其在临床样本中的验证8-40
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-11
• 第一章 导论11-14
• 第二章 材料与方法14-27
• 一、实验材料与主要试剂14-21
• 1.1 细胞系14
• 1.2 病毒14
• 1.3 临床标本14-17
• 1.4 抗体17
• 1.5 主要试剂17-19
• 1.6 主要溶液配制19-20
• 1.7 主要仪器20-21
• 二、实验方法21-27
• 2.1 细胞培养21-22
• 2.2 蛋白提取和定量22-23
• 2.3 免疫印迹实验Western blot23-24
• 2.4 oHSV1-hTERT-GFP方法回收率实验24-25
• 2.5 oHSV1-hTERT-GFP方法检测实体瘤循环肿瘤细胞25
• 2.6 荧光显微镜观察照相25
• 2.7 免疫荧光染色实验25
• 2.8 统计学分析结果25-27
• 第三章 实验结果27-35
• 一、oHSV1-hTERT-GFP方法检测循环肿瘤细胞27-30
• 1.1 端粒酶逆转录酶在不同肿瘤细胞系、正常细胞及肿瘤组织中的表达情况27
• 1.2 oHSV1-hTERT-GFP方法回收率检测27-28
• 1.3 不同肿瘤细胞系转染oHSV1-hTERT-GFP病毒后GFP表达情况28-29
• 1.4 荧光显微镜下观察病毒捕获的循环肿瘤细胞29-30
• 1.5 oHSV1-hTERT-GFP病毒特异示踪肿瘤细胞30
• 二、oHSV1-hTERT-GFP检测循环肿瘤细胞的临床检验效能评估30-33
• 2.1 oHSV1-hTERT-GFP检测肺癌样本中循环肿瘤细胞30-31
• 2.2 oHSV1-hTERT-GFP法检测肝癌患者循环肿瘤细胞31-32
• 2.3 CTCs检测阳性率与局部淋巴结浸润及远处转移的相关性32-33
• 三、oHSV1-hTERT-GFP检测方法与CellSearchTMCTCs Test方法对比33-35
• 第四章 讨论35-39
• 第五章 小结39-40
• 第二部分 oHSV1-hTERT-GFP法检测CTCs在脑胶质瘤中的临床应用40-68
• 摘要40-41
• ABSTRACT41-42
• 第一章 导论42-44
• 第二章 材料和实验方法44-54
• 一、临床标本44-45
• 二、实验材料45-47
• 2.1 主要试剂或试剂盒45-46
• 2.2 主要仪器及耗材46-47
• 三、实验方法47-52
• 3.1 新鲜标本收集47
• 3.2 oHSV1-hTERT-GFP方法检测实体瘤循环肿瘤细胞47
• 3.3 白细胞总RNA样品提取、纯化与鉴定47-49
• 3.4 利用基因芯片检测mRNA表达谱49-52
• 四、数据分析52-54
• 第三章 实验结果54-64
• 一、oHSV1-hTERT-GFP方法检测脑胶质瘤患者CTCs54-55
• 二、对比分析脑胶质瘤患者术前术后CTCs变化55-57
• 三、脑胶质瘤和肺癌脑转移外周血白细胞基因表达结果57-64
• 3.1 标本RNA纯度、完整性质量控制57-58
• 3.2 基因芯片扫描数据质量控制58-60
• 3.3 肺癌脑转移与胶质母细胞瘤外周血白细胞基因表达谱分析60-64
• 第四章 讨论64-67
• 第五章 小结67-68
• 参考文献68-76
• 文献综述76-85
• 参考文献82-85
• 附件85-86
• 已发表论文86-87
• 致谢87-90
• 个人简历90

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