FAT10在肝癌和结肠癌患者血浆中的表达及诊断价值分析

发布时间：2017-09-03 07:06

  本文关键词：FAT10在肝癌和结肠癌患者血浆中的表达及诊断价值分析

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【摘要】：背景和目的肝癌和结肠癌均是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤,在亚太地区恶性肿瘤死亡率中分别位列第3和第5位。且近年来,结肠癌的发病率和死亡率明显上升。早期肝癌缺乏典型临床症状,症状显著者大多已进入中晚期。当前,手术切除是治疗肝癌最好的方法。中晚期肝癌的治疗方案还包括肝动脉栓塞术(TACE),无水酒精注射(PEI)和射频消融术。尽管存在这些治疗方法,但是肝癌的早期诊断仍然是改善患者预后的重要途径。甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)作为肝癌早期诊断的主要血清学诊断指标,因其具有非侵入性的优势被广泛应用。临床应用中发现,AFP在早期肝癌和小肝癌诊断中的敏感性和特异性不够令人满意。早期肝癌中40%的AFP是阴性的。2010年,美国肝病研究协会(AASLD)在其公布的肝癌诊断指南中,不再使用AFP作为肝癌的筛查指标。另外,多数肝癌疑似患者并不容易接受肝脏穿刺活检,因为它属于有创性检查,组织学诊断这一金标准在临床应用中受到限制。因此,探索新的血清学标记物应用于肝癌和结肠癌的早期诊断有一定的必要性。FAT10 mRNA(人类白白细胞抗原信使RNA,human leukocyte antigen-F adjacent transcript 10 mRNA)位于人类6号染色体上,I型主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)编码区域的末端,紧挨人类白细胞抗原的F区,由此而得名。FAT10蛋白包含165个氨基酸残基,最初因为其C端和N端与泛素蛋白高度相似而被命名为双泛素蛋白。FAT10蛋白隶属于类泛素蛋白家族,并且可以通过蛋白酶体系统参与蛋白质的降解过程。fat10mrna定位于真核生物细胞核,通过结合人类纺锤体检查位点mad2参与细胞周期循环管理,mad2的异常调节和染色体不稳定性有关。最近发现,fat10mrna可参与管理细胞周期循环、诱导染色体不稳定性,参与修饰肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)等,而染色体不稳定性可以导致肿瘤发生。我们在前期实验中,应用含有19378个已知基因的核苷酸芯片筛选出肝癌、肝硬化和病毒性肝炎差异基因表达图谱,结果表明fat10基因在肝癌中显著高表达。有研究证明,炎性环境下fat10基因在肝癌和结直肠癌组织中高表达。但是,血浆中fat10mrna及蛋白表达水平,可否作为肝癌和结肠癌的一种血清学诊断标志目前还未有研究。在本实验中,应用实时荧光定量pcr(real-timepcr)技术和酶联免疫吸附实验方法(elisa)测定fat10mrna和蛋白在肝癌、结肠癌、肝硬化及健康志愿者血浆中的表达水平,通过分析fat10蛋白在肝癌和结肠癌诊断中的灵敏度和特异度,评估其临床诊断价值。材料和方法1.材料:临床研究资料:70例肝癌血浆样本取自2014年6月-2015年4月河南省人民医院肝胆外科和消化内科住院患者,另选同期住院60例肝硬化、64例结肠癌患者,64例健康志愿者选自体检中心。70例肝癌中男51例、女19例,年龄54.03岁±8.93岁。所有肝癌患者均进行tnm分期,并使用child-pugh方法评估肝脏功能分级。结肠癌患者中男38例,女26例,年龄53.55岁±6.56岁,使用duke's方法进行分期。肝癌和结肠癌患者血样本收集前均未行放疗或化疗,依靠超声、ct,mri等方法诊断,且经术后病理证实。正常对照组选取同时期体检健康志愿者,所有参加研究患者均签署知情同意书,本研究经医院伦理委员会批准。2.方法:2.1pcr:分别提取肝癌、结肠癌、肝硬化和健康对照组血浆中总rna,应用紫外分光光度计检测a260/a280吸光度比值,若a260/a280在1.8-2.0之间说明所提取的rna纯度良好,可进行反转录合成cdna,随后严格按照购自日本takara公司的rt-pcr试剂盒检测不同组别中血浆fat10mrna阳性表达率,pcr反应结束后出现熔解曲线和扩增曲线,将ct值在18-35之间定义为表达阳性,利用所得ct值计算产物相对表达量。2.2.elisa检测随机选取部分血浆进一步进行elisa实验,本实验选取肝癌血浆70例,肝硬化血浆40例,结肠癌患者、正常人血浆各32例,实验前规划空白孔、标准品孔、样本孔,严格按照fat10-elisa试剂盒说明书进行操作。实验结束后,利用96孔酶标仪测出每孔相应的od值。根据标准品绘制标准曲线,或者得出四参数分析公式,通过已知标准品浓度值计算样品浓度值。3.统计分析fat10mrna相对表达量和蛋白计量资料以均数士标准差(mean士sd)表示。多组之间比较采用方差分析、kruskal-wallis秩和检验,两组间均数比较采用t检验、mann-whitneyu检验。fat10和afp与临床特征之间相关检验运用mann-whitneyu检验或者kruskal-wallis检验。受试者工作特征曲线(roccurve)被用于分析fat10蛋白和afp蛋白的诊断价值。应用spss22.0统计学软件分析肝癌、肝硬化及健康组之间fat10mrna和蛋白表达频率差异。制图工具选用graphpad6.0版((graphpadsoftware,lajolla,ca,usa)。双侧检验p0.05为差异有统计学意义。结果1.fat10mrna在各组中的表达水平肝癌、肝硬化、健康组血浆fat10mrna的阳性表达率分别为72.85%(51/70),28.3%(17/60)和12.5%(8/64),三者之间比较差异具有统计学意义(p0.01);肝癌组fat10阳性表达率明显高与肝硬化组(p0.01)和正常志愿者(p0.01)。肝硬化组与健康志愿者比较无明显统计学差异(p0.05)。三组中fat10mrna的相对表达量分别为6.83士3.37,2.14士0.70,1.08士0.46,三组之间比较差异有统计学意义(p0.01)。肝硬化和健康志愿者之间差异无明显统计学差异。肝癌患者血浆fat10mrna表达水平与肝癌tnm分期及淋巴结转移显著相关。同时发现,结肠癌组中fat10mrna相对表达量为4.04士3.33,阳性表达率为59.4%(38/64),与健康组比较差异具有显著的统计学意义(p0.01),且fat10mrna上调表达与结肠癌duke’s分期(p0.05)及远处转移相关(p0.05)。fat10mrna在afp阴性肝癌中的敏感度为68.8%,当比较小肝癌和非肝癌组(肝硬化和健康志愿者)时,发现其敏感度为68.8%,特异度为79.8%。2.fat10蛋白表达水平血浆fat10蛋白在肝癌、肝硬化、健康志愿者中平均表达浓度依次是293.855±127.61pg/ml、169.30±58.659pg/ml、142.87±70.08pg/ml。三组差异具有统计学意义(χ2=53.34,p0.01)。肝癌组分别与肝硬化、健康组比较均具有明显统计学差异(p0.05)。肝硬化和健康组比较无明显统计学差异(p=0.086),尽管fat10蛋白在肝硬化中也有轻度上调表达。肝癌血浆中fat10蛋白浓度高表达与tnm分期(p=0.034,0.05)和远处转移密切相关((p=0.032,0.05)。fat10蛋白在afp阴性肝癌,小肝癌的平均表达浓度依次是271.57±128.68pg/ml、299.71±110.02pg/ml。分别与健康志愿者比较,差异均具有统计学意义(p0.05)。血浆fat10蛋白在结肠癌的平均表达浓度是192.806±61.69pg/ml。结肠癌组和健康组比较差异均具有统计学意义(p0.05),并且fat10蛋白在结肠癌中的浓度与结肠癌患者duck’s分期和远处转移相关。3.roc曲线分析结果利用roc分析血浆fat10蛋白浓度结果,综合灵敏度和特异度分析诊断方法的准确度。当肝癌与非肝癌组相比较时,根据国际推荐标准,以20ng/ml为afp临界值,得出afp蛋白敏感度和特异度分别为78.6%和81.9%。运用roc曲线,得出fat10蛋白质最佳临界值为194.14pg/ml,肝癌与健康组相鉴别auc值为0.874(95%置信区间:0.800-0.949),敏感度78.6%,特异度87.5%。肝癌与肝硬化相鉴别auc值为0.826(95%置信区间:0.749-0.903),敏感度为78.6%,特异度77.5%。小肝癌与非肝癌相鉴别auc值为0.865(95%置信区间:0.717-0.955)。当小肝癌组与肝硬化相鉴别时敏感度和特异度分别为75.0%和77.5%、与健康志愿者组相鉴别时fat10的敏感度和特异度分别为75.0%和84.4%。联合fat10蛋白和afp蛋白,诊断敏感度可以上升到81.3%。roc曲线分析发现当afp阴性肝癌与非肝癌组比较时,auc值是0.836(95%置信区间:0.724-0.947),进一步分析当afp阴性肝癌分别与肝硬化、健康组相鉴别均具有较好的诊断意义,auc值分别为0.797(95%置信区间:0.660-0.934)、0.884(95%置信区间:0.785-0.982);特异度分别为77.5%、87.5%。结论1.肝癌组血浆中FAT10 mRNA和蛋白水平较对照组均明显增高。FAT10mRNA与肝癌TNM分期及淋巴结转移相关。FAT10蛋白与肝癌的TNM分期及远处转移密切相关。血浆FAT10 mRNA和蛋白在结肠癌患者中的表达水平较健康志愿者明显升高,并且与肿瘤Duke’s分期及远处转移相关。这些提示FAT10可能参与肝癌和结肠癌的发生和进展。2.ROC曲线表明FAT10蛋白作为肝癌无创性诊断标志物具有较高的准确度,且FAT10有可能成为肝癌和结肠癌诊断中的一个新的血清学指标,另外,它还可以应用于AFP阴性肝癌和早期肝癌的辅助诊断,联合FAT10和AFP蛋白可以提高肝癌的正确诊断率。
【关键词】：肝癌 结肠癌 FAT10 mRNA AFP 酶联免疫吸附测定 实时荧光定量
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735
【目录】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文缩略对照表16-17
• 引言17-19
• 材料与方法19-25
• 结果25-36
• 讨论36-38
• 结论38-39
• 参考文献39-41
• 综述 类泛素蛋白家族在肿瘤中的研究和进展41-53
• 参考文献48-53
• 个人简介及发表文章53-54
• 致谢54

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本文编号：783532