NM23-H2通过诱导自噬抑制胃癌细胞EMT的发生

发布时间：2017-09-03 11:38

  本文关键词：NM23-H2通过诱导自噬抑制胃癌细胞EMT的发生

  更多相关文章： NM23-H2 胃癌细胞 上皮间质转化 自噬 侵袭 迁移

【摘要】：目的探讨NM23-H2高表达抑制胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移的相关机制。方法1.复苏胃癌BGC-NM23H2稳定转染组细胞及BGC-MOCK稳定转染空载体组细胞,免疫印迹实验法鉴定。2.光镜观察细胞形态改变。3.免疫印迹法检测EMT相关标志物E-cadherin和vimentin表达。4.免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平。5.透射电镜观察细胞自噬体形成及超微结构。6.MDC染色免疫荧光观察自噬泡形成。7.氯喹抑制自噬,免疫印迹法检测EMT相关标志物E-cadherin和vimentin的表达水平。8. Trans well小室观察NM23-H2高表达后,BGC-823细胞侵袭和迁移能力的改变。结果1.复苏胃癌BGC-NM23H2稳定转染组细胞及BGC-MOCK稳定转染空载体组细胞,免疫印迹法鉴定,BGC-NM23H2细胞NM23-H2表达高于BGC-823细胞组与BGC-MOCK空载体组细胞(P0.01)。2. TGF-β1诱导细胞发生EMT, BGC-NM23H2+TGF-β1处理组E-cadherin水平上升,vimentin水平明显下降(P0.001)。3. BGC-NM23H2细胞与BGC-823细胞组和BGC-MOCK空载体组细胞相比,LC3Ⅱ的表达水平明显升高(P0.01),电镜和MDC染色免疫荧光实验结果表明自噬发生。4.使用氯喹抑制自噬后,观察到BGC-NM23H2细胞EMT相关标记物E-cadherin水平下降,vimentin水平升高(P0.01)。5.BGC-823高表达NM23-H2,其侵袭力和迁移力明显被抑制(P0.01),当自噬被抑制后,BGC-NM23H2细胞的侵袭和迁移力明显增强(P0.01)。结论1.NM23-H2抑制BGC-823细胞发生EMT。2.NM23-H2促进BGC-823细胞发生自噬。3.抑制自噬后NM23-H2抑制BGC-823细胞发生EMT的作用有所减弱。4.NM23-H2抑制BGC-823细胞的侵袭和迁移能力,作用机制可能与诱导自噬发生从而抑制EMT有关。
【关键词】：NM23-H2 胃癌细胞 上皮间质转化 自噬 侵袭 迁移
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-15
• 材料与方法15-26
• 1. 实验相关细胞株15
• 2. 主要试剂15-16
• 3. 主要仪器16-17
• 4. 主要试剂的配制方法17-21
• 4.1 DMEM高糖培养液的配制17
• 4.2 细胞冻存液的配制17
• 4.3 胎牛血清处理17
• 4.4 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01M,pH值7.2-7.4)的配制17
• 4.5 0.25%胰酶的配制17-18
• 4.6 柠檬酸盐缓冲液(0.01M,pH值3.0)的配制18
• 4.7 4%多聚甲醛配制18
• 4.8 5mg/ml的MTT溶液配制方法18
• 4.9 氯喹(CQ)的配制18
• 4.10 3%浓度的戊二醛配制18
• 4.11 0.1mg/ml(1%)BSA封闭液18
• 4.12 TGF-β1抗体的配制18
• 4.13 0.1%甲基紫溶液的配制18-19
• 4.14 次强酸的配制19
• 4.15 MDC溶液的配制19
• 4.16 Ⅳ型胶原的配制19
• 4.17 Western blot免疫印迹主要试剂配制19-21
• 5. 主要实验方法21-25
• 5.1 细胞培养及分组21-22
• 5.2 细胞形态观察22
• 5.3 自噬体形态观察22
• 5.4 MDC染色免疫荧光观察细胞自噬泡形成22
• 5.5 MTT法测氯喹浓度对细胞存活率影响22-23
• 5.6 Transwell小室实验23
• 5.7 Western Blot(免疫印迹)分析23-25
• 6. 统计学分析25-26
• 结果26-29
• 1. 鉴定胃癌BGC-823细胞稳定转染NM23-H2基因26
• 2. NM23-H2抑制胃癌BGC-823细胞发生EMT26
• 2.1 检测BGC-NM23H2细胞EMT相关标志物的改变26
• 2.2 观察BGC-823细胞高表达NM23-H2细胞形态的改变26
• 3. NM23-H2诱导胃癌BGC-823细胞发生自噬26-27
• 3.1 检测BGC-NM23H2细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达水平26
• 3.2 观察BGC-NM23H2细胞自噬囊泡的形成26-27
• 3.3 观察BGC-NM23H2细胞超微结构27
• 4. 抑制自噬后BGC-NM23H2细胞EMT的改变27-28
• 4.1 筛选最适氯喹浓度27
• 4.2 氯喹作用细胞后自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平27
• 4.3 氯喹作用细胞后自噬囊泡的形成27
• 4.4 抑制自噬后BGC-NM23H2细胞EMT的改变27-28
• 5. 抑制自噬后胃癌BGC-823细胞侵袭及迁移力的改变28-29
• 5.1 抑制自噬后胃癌BGC-823细胞侵袭力的改变28
• 5.2 抑制自噬后胃癌BGC-823细胞迁移力的改变28-29
• 讨论29-32
• 结论32-33
• 参考文献33-38
• 附图38-49
• 攻读硕士学位期间发表的论文49-50
• 致谢50

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