基于链特异性测序的肝癌HepG2细胞系IncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建

发布时间：2017-09-04 19:10

  本文关键词：基于链特异性测序的肝癌HepG2细胞系IncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建

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【摘要】：对于肝癌发生发展的机制仍然缺乏一个系统的认识,特别是不同致病因素及其相互作用在肝癌的作用仍知之甚少,尚未确定的关键基因组或者分子异常表达对HCC诊断率提高或介入治疗的靶向性都有帮助。最近的数据表明,非编码RNA发现及功能研究表明其在肝癌的发生、发展、转移过程中扮演着非常重要的角色。深入研究非编码RNA在肝癌发生过程中的分子作用机制,从而筛选新的诊断标志物和治疗靶点成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤坏死因子TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬细胞而分泌、具有多种生物活性的炎性细胞因子,与其他细胞因子共同作用,激活免疫反应,导致肿瘤坏死。本研究以HL-7702/HepG2作为实验目标并分为两个实验组,分别对其总RNA去后rRNA采用链特异性RNA测序技术,使用生物信息学方法获得mRNA/IncRNA表达谱数据,同时对于差异mRNA进行了功能注释,为研究IncRNA调控作用,使用DIANA-TarBase v7.0和IncBaseSoftware分别得到miRNA-mRNA、 miRNA-IncRNA关系对,最终得到IncRNA-miRNA-mRNA三元互相调控网络。本论文试图分析在肝癌发生及TNF-α诱导过程中与其关联的miRNA.mRNA和IncRNA,构建IncRNA-miRNA-mRNA三元互相调控网络,从而筛选出特定mRNA/lncRNA作为肿瘤早期诊断标志物、恶性评估及预后判断指标,同时也为分子生物学机制提供—定的理论依据。本论文主要分为两部分：1.培养HL-7702及HepG2细胞系,进行去核糖体链特异性建库测序,使用生物信息学方法进行数据质控、read比对、转录本组装等,采用FPKM的方法对表达水平进行归一化,筛选出具有显著差异表达的mRNA/IncRNA。共得到差异表达的mRNA 3035个,其中上调表达1384个,下调表达1651个；显著差异表达的IncRNA有57个,其中上调的有23个,下调的有34个(筛选标准|log2 ratio|1, FDR0.01)。对于差异表达的mRNA进行了GO注释,发现了其中与细胞增殖和胞凋亡、死亡有关的共有23个,同时也发现4个与肿瘤发生相关的通路：ErbB、JAK-STAT、mTOR以及WNT signalingpathways,表明相关基因参与了上述生物学过程促进了肝癌的发生。结合实验室之前有IniRNA相关研究,miRNA和IncRNA及mRNA都存在相互调控,我们采用DIANA TOOL生物信息学分析工具对差异表达IncRNA进行了IncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析,最终得到转录后水平上非编码RNA在肝癌发生过程中的调控图。2.培养HepG2细胞系,其中一组使用TNF-α处理3小时,然后对处理前后的细胞系进行去核糖体RNA链特异建库测序。采用第一部分相同的生物信息学分析策略,得到有显著差异表达的mRNA/IncRNA。发现差异表达的mRNA114个,其中上调102个,下调表达12个；差异IncRNA共发现差异表达的46个,其中上调38个,下调8个(|log2 (fold-change)|1, q_value0.05)。对于差异表达的mRNA的功能注释发现,一些炎症因子IL6, ILIB、IL8参与到TNF-α介导的凋亡与癌症通路,同时也注意到NF-KB通路中NFKIBA, NFKB1, IKBKE等基因的变化,这些差异基因一起参与了TNF-α介导肿瘤细胞凋亡过程。结合实验室之前有miRNA相关研究,miRNA和IncRNA及mRNA都存在相互调控,所以对于差异表达IncRNA我们采用DIANA TOOL工具进行了IncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析,得到转录后水平上三种RNA之间调控网络关系图。本研究选取HL-7702和HepG2细胞系作为研究对象,其中一组HepG2细胞系使用TNF-α进行处理,希望获得肿瘤细胞增殖过程中以及TNF-α介导肿瘤细胞凋亡过程中的分子机制,得到在mRNA和非编码RNA层次上调控网络图,然而还需要更多的实验支持。
【关键词】：HL-7702/HepG2 TNF-α 去核糖体RNA链特异性测序 lncRNA-mRNA-miRNA调控网络
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-22
• 1.1 研究背景12-20
• 1.1.1 高通量测序技术13-15
• 1.1.2 lncRNA研究15-18
• 1.1.2.1 lncRNA概述15-16
• 1.1.2.2 lncRNA与肝癌研究16-18
• 1.1.3 TNF-α简介18-20
• 1.1.3.1 TNF-α的命名及结构18-19
• 1.1.3.2 TNF-α的功能19
• 1.1.3.3 TNF-α的信号通路19-20
• 1.2 研究内容及意义20-21
• 1.3 论文组织结构21-22
• 第二章 HL-7702/HepG2肝癌细胞lncRNA/mRNA表达谱22-42
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料与方法22-30
• 2.2.1 细胞培养22
• 2.2.2 Trizol法Total RNA提取22-23
• 2.2.3 总RNA样本质量检测23
• 2.2.4 测序流程23-25
• 2.2.5 mRNA/lncRNA测序数据质量分析25-30
• 2.3 mRNA表达谱分析30-36
• 2.3.1 表达差异归一化方法30-31
• 2.3.2 数据筛选31-32
• 2.3.3 mRNA功能注释32-34
• 2.3.4 可变剪切分析34-36
• 2.4 lncRNA表达谱36-39
• 2.4.1 lncRNA统计分析36
• 2.4.2 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络36-39
• 2.4.2.1 lncRNA-miRNA相互调控分析36-37
• 2.4.2.2 mRNA-miRNA表达谱关联分析37-38
• 2.4.2.3 lncRNA-miRNA-mRNA调控分析结果38-39
• 2.5 本章小结39-42
• 第三章 TNF-α处理前后HepG2肝癌细胞mRNA/lncRNA表达谱42-56
• 3.1 引言42
• 3.2 实验材料与方法42-48
• 3.2.1 细胞培养42
• 3.2.2 总RNA样本质量检测42
• 3.2.3 测序流程42-44
• 3.2.4 mRNA/lncRNA测序数据质量分析44-48
• 3.3 mRNA表达谱分析48-51
• 3.3.1 mRNA表达差异基因48-49
• 3.3.2 mRNA功能注释49-50
• 3.3.3 可变剪切分析50-51
• 3.4 lncRNA差异分析51-53
• 3.4.1 lncRNA统计分析51-52
• 3.4.2 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络52-53
• 3.4.2.1 lncRNA-miRNA相互调控分析52
• 3.4.2.2 mRNA-miRNA表达谱关联分析52
• 3.4.2.3 lncRNA-miRNA-mRNA调控分析结果52-53
• 3.5 本章小结53-56
• 第四章 总结与展望56-60
• 参考文献60-66
• 附表一 与癌症相关的mRNA及其富集部分GO Term66-73
• 附表二 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络图73-75
• 附表三 与TNF-α诱导相关的mRNA及其富集的GO Tem75-80
• 致谢80-81
• 作者简介81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 丁楠;渠鸿竹;方向东;;ENCODE计划和功能基因组研究[J];遗传;2014年03期

2 韦贵将;邹秉杰;陈之遥;宋沁馨;李佑志;周国华;;新一代测序技术的研究进展[J];现代生物医学进展;2012年19期

3 王兴春;杨致荣;王敏;李玮;李生才;;高通量测序技术及其应用[J];中国生物工程杂志;2012年01期

4 杨旭;焦睿;杨琳;吴莉萍;李英睿;王俊;;基于新一代高通量技术的人类疾病组学研究策略[J];遗传;2011年08期

5 宋红丽;郑卫萍;刘津;王建;高宇;徐卫团;沈中阳;;甲泼尼龙对HepG2和HL-7702细胞增殖活性影响的研究[J];天津医药;2009年05期

6 蔡永娥;乔建锦;孙晓茹;崔英;;我国原发性肝癌研究进展[J];现代肿瘤医学;2008年01期

7 陈富强;李煜;李瑶;王振飞;贾瑞贞;;人肝癌细胞系HepG2生物学特性分析[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2007年03期

8 吕志敢;郭政;;肿瘤坏死因子的研究进展[J];山西医科大学学报;2006年03期

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本文编号：793310