RNAi沉默Rap2B基因对恶性转化BEAS-2B细胞的作用
发布时间：2017-09-05 08:46
本文关键词：RNAi沉默Rap2B基因对恶性转化BEAS-2B细胞的作用
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【摘要】：目的Rap2B在肺癌组织中高表达。Rap2B表达量增高能够激活NF-κB通路以及MAPK亚通路P38活化。本研究拟通过RNAi技术沉默Rap2B基因,观察Rap2B基因被沉默后,细胞内NF-κB、p38在m RNA及蛋白质水平的表达以及细胞的克隆形成率、增殖能力、迁移能力、细胞凋亡和细胞周期的变化,探索Rap2B在肺癌的发生、发展过程中的作用,为将Rap2B作为一种治疗肺癌的高效、特异的生物靶标提供理论支持。方法1.以B(a)P为染毒物,染毒BEAS-2B细胞,构建恶性转化的BEAS-2B细胞系。设立空白对照组、二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)溶剂对照组、苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene,B(a)P)染毒组。采用RT-PCR、Western blot技术检测各组Rap2B基因和蛋白的表达情况。2.小干扰RNA(Small Interfering RNA,si RNA)通过Lipofectamine TM2000转染恶性转化的BEAS-2B细胞,从3条si RNA序列中筛选出1条沉默Rap2B基因的最佳序列,RT-PCR验证其结果;观察Rap2B基因被沉默后,细胞内p65、p38在m RNA及蛋白质水平的表达以及细胞的克隆形成率、增殖能力、迁移能力、细胞凋亡和细胞周期的变化。结果1.恶性转化BEAS-2B细胞的建立经细胞形态学观察和软琼脂克隆形成实验,表明细胞发生了恶性转化。2.Rap2B在恶性转化BEAS-2B细胞中的表达B(a)P组Rap2B基因m RNA表达量高于空白对照组和DMSO组,差异均有统计学意义(均P0.001);B(a)P组Rap2B蛋白表达量高于空白对照组和DMSO组,差异均有统计学意义(均P0.001)。3.细胞转染效率和Rap2B基因干扰效率的检测细胞转染6h后,荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率为90.39%;干扰Rap2B基因效果最佳的si RNA为Rap2b-homo-814,干扰效率为82.3%。4.沉默Rap2B基因后细胞的增殖和迁移能力变化MTT法观察转染后各组细胞的生长状况:干扰Rap2B基因后能够明显抑制恶性转化BEAS-2B细胞的生长,与RNAi-组、NC组相比差异有统计学意义(均P㩳0.001);划痕实验检测Rap2B基因被干扰后恶性转化BEAS-2B细胞的迁移能力,RNAi-组和NC组平均间隙差异无统计学意义(P=0.739),而RNAi+组平均间隙与RNAi-组、NC组相比差异均有统计学意义(均P㩳0.001)。5.沉默Rap2B基因后细胞细胞凋亡和周期的变化RNAi+组细胞凋亡率与RNAi-组、NC组相比明显升高,差异有统计学意义(均P㩳0.001),而RNAi-组和NC组的凋亡率相比差异无统计学意义(P=0.226);RNAi+组G1期细胞百分比与RNAi-组、NC组相比明显升高,差异有统计学意义(均P㩳0.001)。S期细胞百分比与RNAi-组、NC组相比明显降低,差异有统计学意义(均P㩳0.001)。G2/M期细胞百分比与RNAi-组、NC组相比明显降低,差异有统计学意义(均P㩳0.001),而RNAi-组和NC组各期细胞百分比相比差异无统计学意义(P=0.820,P=923,P=0.791)。6.沉默Rap2B基因后p38、p65基因和蛋白的表达情况RNAi-组与NC组相比p38、p65基因m RNA表达水平差异均无统计学意义(P=0.612,P=0.408),而RNAi+组p38、p65基因m RNA表达量均明显低于RNAi-组和NC组,差异均有统计学意义(均P㩳0.001);RNAi-组与NC组相比p38、p65蛋白表达量差异均无统计学意义(P=0.158,P=0.111),而RNAi+组p38、p65蛋白表达量均明显低于RNAi-组和NC组,差异均有统计学意义(均P㩳0.001)。结论沉默Rap2B基因被后,可以使p38、p65基因和蛋白相对表达量降低,从而抑制NF-κB通路和MAPK通路的活性,从而减弱细胞的增殖和迁移能力,促进细胞的凋亡,将细胞阻滞于G0/G1期,细胞分裂明显减缓。
【关键词】：苯并[α]芘 BEAS-2B细胞 RNAi NF-κB通路 MAPK通路
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-14
- Abbreviations table14-15
- 1 引言15-17
- 2 材料与方法17-32
- 2.1 材料17-21
- 2.1.1 实验对象与受试物17
- 2.1.2 主要实验仪器17-18
- 2.1.3 主要实验试剂18-19
- 2.1.4 主要试剂配制19-21
- 2.2 实验方法21-32
- 2.2.1 细胞培养21-22
- 2.2.2 细胞染毒及恶性转化细胞株的建立22
- 2.2.3 软琼脂克隆形成实验22-23
- 2.2.4 BEAS-2B细胞RNAi处理23-25
- 2.2.5 RT-PCR分析25-27
- 2.2.6 RT-PCR检测基因Rap2B、P38 和P65 的表达27
- 2.2.7 Western blot检测Rap2B、P38 和P65 蛋白的表达27-30
- 2.2.8 细胞划痕实验测定细胞迁移能力30
- 2.2.9 MTT实验30
- 2.2.10 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡30-31
- 2.2.11 统计分析31-32
- 3 结果32-47
- 3.1 恶性转化细胞系的建立32-33
- 3.1.1 细胞形态学观察32
- 3.1.2 软琼脂克隆形成实验32-33
- 3.2 Rap2B在恶性转BEAS-2B化细胞中的表达33-37
- 3.2.1 细胞总RNA纯度及完整性测定结果33
- 3.2.2 荧光定量PCR检测结果33-35
- 3.2.3 Western Blot检测细胞蛋白结果35-37
- 3.3 细胞转染效率测定的结果37-38
- 3.3.1 细胞转染后荧光显微镜下观察结果37
- 3.3.2 流式细胞仪检测细胞转染效率的结果37-38
- 3.4 Rap2B基因干扰效率的检测结果38
- 3.5 软琼脂克隆形成实验38-39
- 3.6 细胞划痕实验39-41
- 3.7 MTT法检测各组细胞增殖情况41-42
- 3.8 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和周期情况42-43
- 3.8.1 流式细胞仪检测细胞凋亡42
- 3.8.2 流式细胞仪检测细胞周期42-43
- 3.9 Rap2B基因干扰后对p38、p65 的影响43-47
- 3.9.1 荧光定量PCR检测p38、p65 基因表达量结果43-45
- 3.9.2 Western Blot检测细胞p38、p65 蛋白表达量45-47
- 4 讨论47-52
- 4.1 BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立48
- 4.2 恶性转化BEAS-2B细胞Rap2B基因和蛋白的表达48
- 4.3 干扰 Rap2B 基因后对细胞增殖和迁移能力的影响48-49
- 4.4 干扰Rap2B基因后对细胞增殖和迁移能力的影响49-50
- 4.5 Rap2B 基因干扰后对 p38、p65 基因和蛋白表达的影响50-52
- 5 结论52-53
- 参考文献53-57
- 综述 Rap2B基因的研究现状57-70
- 1．Rap2B基因与肺癌57-59
- 2. Rap2B基因与MAPK通路59-61
- 2.1 MAPK信号通路与肿瘤的关系60
- 2.2 ＭＡＰＫ信号通路的基本组成60-61
- 2.3 P38 转导通路与肿瘤的关系61
- 3. Rap2B基因与NF-κB通路61-65
- 3.1 NF-κB通路与肿瘤62-63
- 3.2 NF-κB通路与恶性转化的关系63-64
- 3.3 NF-κB通路对凋亡的影响64
- 3.4 NF-κB通路对血管形成及转移的作用64-65
- 4.结束语65-66
- 参考文献66-70
- 个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果70-71
- 致谢71
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 姚琴;任明姬;赵鹏伟;;MAPK转导通路在肿瘤发生发展中的作用[J];内蒙古医学杂志;2014年10期
，本文编号：797002
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