甲基转移酶、生物硫醇检测新方法研究

发布时间：2017-09-06 13:09

  本文关键词：甲基转移酶、生物硫醇检测新方法研究

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【摘要】：DNA甲基化在人类基因组中表观遗传修饰和在基因的调控中起重要作用。在异常的甲基化中,甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到CpG岛上胞嘧啶的C5位置上。CpG岛中基因启动子区域异常甲基化是新一代癌症生物标志物,因此,对于快速检测DNA甲基化和转移酶活性可以为早期癌症诊断提供一种有效的方法。然而,传统分析检测甲基转移酶的方法具有耗时、费用高以及灵敏度不高等缺点。所以,迫切需要发展新方法,实现快速、简单、灵敏检测甲基转移酶活性,同时检测CpG岛的甲基位点可以用于确定特定的癌症类型。为抗癌药物发展和癌症诊断提供了理论基础。本文研究内容主要包括以下两个方面:(1)基于酶辅助双信号放大的电化学方法高灵敏检测Dam甲基转移酶活性。首先,通过DNA杂交作用将二茂铁-DNA(S2)组装到巯基-DNA(S1)修饰电极表面,产生二茂铁的良好电化学信号。Dam甲基转移酶能将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移到发夹DNA的腺嘌呤的N6位置上,进而限制性内切酶Dpn I将发生甲基化的发夹DNA在甲基化位点剪切,释放出单链DNA(S3)。将制备的巯基-DNA(S1)和二茂铁-DNA(S2)修饰金电极探针浸泡在以上溶液中,释放出的S3与修饰金电极双链探针中的S2凸出的部分杂交形成新的双链DNA。经核酸外切酶III作用,能够从新形成的双链DNA的S2的3′端进行剪切,导致二茂铁脱离电极表面。释放出的S3继续与修饰金电极双链探针中的S2凸出的部分杂交形成新的双链DNA而进入下一个剪切放大循环,多次循环,使得S2标记的二茂铁大量脱离电极表面导致二茂铁的电流强度下降,同时电极表面的大量巯基化单链S1被释放出来,将电极浸泡在含有血红素和钾离子的溶液中,形成的G-四链体-血红素复合物。电化学测量结果表明,由于二茂铁脱离电极表面而电流降低,电极表面的单链S1与血红素形成G-四链体-血红素复合物而电流增强,通过二者电流强度之比即可实现Dam甲基转移酶的灵敏检测。本方法的优点如下:(1)对Dam甲基转移酶的检测限能够达到4.8×10-3 U mL-1,灵敏度远远高于其他检测方法;(2)对Dam甲基转移酶识别的特异性强,其他的甲基转移酶,如M.SssI甲基转移酶,不干扰测定,所以,本方法的选择性高;(3)可用于Dam甲基转移酶抑制剂的筛选,结果表明丝裂霉素、顺氯氨铂对Dam甲基转移酶没有影响,而青霉素和5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶的活性有明显抑制效果,其中5-氟尿嘧啶对Dam甲基转移酶抑制效果最强。(2)建立了一种基于SAM和金纳米粒子的生物硫醇免标记比色检测法。SAM包含一个高能的手性硫离子,该硫离子分别与甲基、无碳糖、以及甲硫氨酸连接。硫带有孤对电子,五碳糖上含有一个高电负性的氧,能够使硫原子的孤对电子转移到氧原子上,从而使得SAM分子带正电;而柠檬酸三钠还原合成的金纳米粒子表面带负电。当SAM与金纳米粒子混合,SAM可以中和金纳米粒子表面的电荷,导致金纳米粒子之间的排斥力减小,从而使得金纳米粒子发生团聚,金纳米粒子溶液的颜色由红色变成蓝色。由于生物硫醇含巯基官能团,能够通过金硫键作用阻碍SAM诱导金纳米粒子的团聚,因此当生物硫醇存在时,金纳米粒子溶液颜色不变。据此,建立了生物硫醇的比色检测方法。此外,在检测生物硫醇的过程中,金纳米粒子溶液颜色的变化还能够通过裸眼观察到,因此可以实现生物硫醇的可视化检测。在最佳的实验条件下,半胱氨酸、谷胱甘肽和高半胱氨酸检测的线性范围分别为0.4-1.2μM、0.2-0.9μM和0.6-3.0μM;检测限分别为35.8 nM、21.7 nM和62.4 nM。与其他比色法相比,本方法的灵敏度高。本方法也能应用检测血清中生物硫醇的总含量,回收率范围为96.5%到104.4%,表明检测血清样品中生物硫醇时没有明显的干扰物质。
【关键词】：Dam甲基转移酶 电化学 比色法 生物硫醇 金纳米粒子
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4;O657.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第1章 引言9-21
• 1.1 概述9-10
• 1.2 DNA甲基化10-19
• 1.2.1 DNA甲基化的概念10-12
• 1.2.2 DNA甲基化的检测方法12-13
• 1.2.3 DNA甲基转移酶13-19
• 1.3 本论文主要研究内容19-21
• 第2章 基于Exonuclease III酶辅助循环放大双电流信号检测甲基转移酶21-35
• 2.1 引言21-23
• 2.2 实验部分23-26
• 2.2.1 实验试剂23
• 2.2.2 实验仪器23-24
• 2.2.3 金电极处理24
• 2.2.4 电极探针的制备24
• 2.2.5 DNA甲基化24-25
• 2.2.6 电化学检测甲基转移酶活性25
• 2.2.7 抑制剂对Dam甲基转移酶活性影响25
• 2.2.8 Dam甲基转移酶传感器选择性25-26
• 2.3 实验结果与讨论26-34
• 2.3.1 DNA甲基转移酶检测原理26-27
• 2.3.2 Dam甲基转移酶检测可行性分析27-28
• 2.3.3 DNA金电极修饰和表征28-29
• 2.3.4 Dam甲基转移酶传感器表征29-30
• 2.3.5 实验条件优化30-31
• 2.3.6 Dam 甲基转移酶活性检测31-32
• 2.3.7 甲基转移酶的抑制剂筛选和考察32-33
• 2.3.8 选择性实验33-34
• 2.4 结论34-35
• 第3章 基于SAM和金纳米粒子免标记比色法检测生物硫醇35-46
• 3.1 引言35-36
• 3.2 实验部分36-37
• 3.2.1 试剂36
• 3.2.2 仪器36-37
• 3.2.3 实验步骤37
• 3.3 结果与讨论37-45
• 3.3.1 传感器检测生物硫醇的实验原理38-39
• 3.3.2 传感器的表征39
• 3.3.3 优化实验条件39-41
• 3.3.4 生物硫醇的检测41-44
• 3.3.5 传感器在生物领域的应用44-45
• 3.3.6 生物传感器的选择性45
• 3.4 结论45-46
• 展望46-47
• 参考文献47-56
• 致谢56-57
• 攻读学位期间的研究成果57

【共引文献】

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本文编号：803299