miR-141-3p对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响及其作用机制的探讨

发布时间：2017-09-06 13:19

  本文关键词：miR-141-3p对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响及其作用机制的探讨

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【摘要】：前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤,在发达国家的发病率及死亡率一直居高不下,在我国近年来的发病率亦呈上升趋势。目前已有越来越多的研究表明,mi RNA通过发挥癌基因或抑癌基因的功能,在肿瘤的发生发展中发挥作用。mi RNA是细胞内长约22个核苷酸的非编码单链RNA,mi RNA通过结合靶m RNA的3'UTR来抑制目的m RNA的翻译或降解,从而调控目的基因的表达。mi R-141是mi R-200家族成员之一,其编码基因位于12号染色体,mi R-141的前体pre-mi RNA在胞浆内可加工生成mi R-141-3p和mi R-141-5p两种成熟mi RNA。研究显示,与正常前列腺组织相比,mi R-141(mi R-141-5p)在前列腺癌组织中表达上调,并且可以在前列腺癌患者的外周血中检测到。一项针对早期前列腺癌患者和转移性前列腺癌患者的血清mi RNA的小样本研究显示,mi R-141和mi R-375是重要的诊断和评估预后的生物分子标志物。Lodes等对前列腺癌患者的血清mi RNA表达谱进行分析,结果显示,与正常对照相比,前列腺癌患者血清中有15种mi RNA表达上调,其中mi R-141与局部进展性前列腺癌具有相关性。上述有关mi R-141相关文献中用到的均为mi R-141-5p(5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’)的功能,mi R-141-3p在前列腺癌组织中表达如何,在前列腺癌的发生、发展中是否发挥作用,尚不清楚。研究显示,前列腺的发展与雄激素受体(androgen receptor,AR)信号调控通路密切相关。雄激素通过结合AR,使AR下游的信号通路被激活,从而将胞外信号传递至胞内,并作用于目标基因来发挥作用。对于早期前列腺肿瘤细胞而言,其生长对雄激素有依赖性,故临床中减少雄激素甚至是阻断雄激素是治疗早期前列腺癌的有效方法。但是,对于那些雄激素非依赖性前列腺肿瘤细胞,内分泌治疗并不能获得良好疗效。同时,这类肿瘤细胞中AR的表达量和AR阳性细胞在整体肿瘤组织中并未明显减少,甚至还有升高的趋势。亦有研究显示,SHP(微小异二源聚体)是mi R-141的靶基因,在人前列腺癌细胞中上调mi R-141的表达之后,SHP的表达下降,从而促进AR的转录活性。提示,mi R-141和AR之间有一定的相互作用。本课题组前期对多种前列腺肿瘤细胞及正常细胞中mi RNA-141-3p的表达进行了检测,结果发现在LNCa P细胞中,mi R41-3p明显低表达。并且,利用Targetscan、Micro Cosm等生物信息学预测软件分析发现,在AR基因的3’UTR区有mi R-141-3p的可能结合位点。进一步对mi R-141-3p低表达在LNCa P细胞生长及增殖中作用及其是否通过靶向AR而发挥作用的机制进行探讨,有利于从新的角度认识前列腺癌发生机制,并为靶向前列腺癌治疗提供新的理论和实验依据。方法:(1)利用Real-time PCR方法,检测LNCa P前列腺癌细胞,PC-3前列腺癌细胞,Sao S-2骨肉瘤细胞,Si Ha宫颈癌细胞,BEAS-2B正常肺上皮细胞,HUVEC静脉内皮细胞等细胞内mi R-141-3p的表达;(2)采用MTT检测、平板克隆形成实验及流式细胞凋亡检测技术,检测了mi R-141-3p对LNCa P细胞增殖和凋亡的影响;(3)利用Targetscan、Micro Cosm等软件分析mi R-141-3p的可能靶基因,(AR3’UTR);(4)转染mi R-141-3p mimics后,RT-PCR和Western blot技术检测LNCa P细胞内AR的表达;(5)构建p MIR-AR-3’UTR荧光报告载体,将p MIR-AR-3’UTR、内参质粒p RL-luciferase、Negative control mimics、mi R-141-3p mimics、Negative control inhibitor、mi R-141-3p inhibitor分别转染LNCa P细胞,检测双萤光素酶的活性;(6)构建p MIR-AR-3’UTR突变载体,将p MIR-AR-Mut、内参质粒p RL-luciferase、Negative control mimics、mi R-141-3p mimics、Negative control inhibitor、mi R-141-3p inhibitor分别转染LNCa P细胞,检测双萤光素酶的活性;(7)化学合成ARE序列,将其连入p GL3-Promoter Vector载体,构建p GL3-ARE荧光报告载体,检测双萤光素酶的活性;(8)RT-PCR等技术检测AR下游靶基因CDC6和MKX的表达。结果:(1)RT-PCR结果显示,与正常细胞BEAS-2B和HUVEC相比,mi R-141-3p在LNCa P细胞中低表达,在骨肉瘤Sao S-2细胞和宫颈癌Si Ha细胞中高表达。(2)MTT检测、平板克隆形成实验及流式细胞凋亡检测结果显示,mi R-141-3p可以抑制LNCa P细胞的增殖,促进LNCa P细胞的凋亡。(3)生物信息学预测软件Targetscan、Micro Cosm等分析可能作用于AR 3’UTR的mi RNA,结果显示,mi R-141-3p的种子序列与AR m RNA的3’UTR区有很高的互补性。(4)PCR结果显示,与对照组(转染Negative control mimics)相比,实验组(转染mi R-141-3p mimics)细胞中AR m RNA水平明显下降;Western blot结果显示,与对照组(转染Negative control mimics))相比,实验组(转染mi R-141-3p mimics)细胞中AR蛋白水平明显下降。(5)双萤光素酶报告基因系统检测mi R-141-3p对AR的靶向作用结果显示(野生型),与对照组(共转p MIR-AR-3’UTR、内参质粒p RL-luciferase和阴性对照,即p MIR-AR-3’UTR-NC mimics,p MIR-AR-3’UTR-NC inhibitor)相比,实验组(共转p MIR-AR-3’UTR、内参质粒p RL-luciferase和mi R-141-3p mimics,即p MIR-AR-3’UTR-mi R-141-3p mimics)的萤光素酶的表达含量显著下降;实验组(共转p MIR-AR-3’UTR、内参质粒p RL-luciferase和mi R-141-3p inhibitor,即p MIR-AR-3’UTR-mi R-141-3p inhibitor)的萤光素酶的表达含量显著增加。(6)双萤光素酶报告基因系统检测mi R-141-3p对AR的靶向作用结果显示(突变型),与对照组(共转p MIR-AR-Mut、内参质粒p RL-luciferase和阴性对照,即p MIR-AR-Mut-NC mimics,p MIR-AR-Mut-NC inhibitor)对照组相比,实验组(共转p MIR-AR-Mut、内参质粒p RL-luciferase和mi R-141-3p mimics、mi R-141-3p inhibitor,即p MIR-AR-Mut-mi R-141-3p mimics,p MIR-AR-Mut-mi R-141-3p inhibitor)的萤光素酶的表达量均无无明显变化。(7)mi R-141-3p对p GL3-ARE(androgen response element,ARE)荧光报告系统检测结果显示:与对照组相比,mi R-141-3p可降低p GL3-ARE的相对荧光素酶活性。(8)Real-time PCR检测结果显示:与转染阴性对照组相比,转染mi R-141-3p mimics后CDC6和MKX m RNA的表达水平降低;与转染阴性对照组相比,转染mi R-141-3p inhibitor后CDC6和MKX m RNA的表达水平升高。结论:mi R-141-3p在LNCa P细胞中低表达;mi R-141-3p可以抑制LNCa P细胞的增殖,促进LNCa P细胞的凋亡;证实AR是mi R-141-3p的靶基因;mi R-141-3p可影响ARE的活性;mi R-141-3p可下调AR下游靶基因CDC6和MKX的表达。
【关键词】：前列腺癌 mi R-141-3p 雄激素受体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-23
• 第一部分 miR-141-3p对前列腺癌LNCaP细胞生长的影响23-31
• 1 材料23-24
• 2 方法24-27
• 3 结果27-30
• 4.小结30-31
• 第二部分 miR-141-3p对前列腺癌细胞LNCaP中AR表达的调控作用31-59
• 1 材料31-33
• 2 方法33-52
• 3 结果52-58
• 4.小结58-59
• 第三部分 miR-141-3p对AR-ARE相互作用及其介导的信号通路的影响59-66
• 1 材料59-61
• 2 方法61-63
• 3 结果63-65
• 4.小结65-66
• 讨论66-68
• 小结68-69
• 参考文献69-78
• 个人简历和研究成果78-79
• 致谢79

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 刘游鸿;李雄;;FOXM1和雄激素受体(AR)转录因子相互作用调节CDC6基因转录DNA复制和促进前列腺癌细胞增殖的分子机理[A];中国病理生理学会第十三届肿瘤、第十四届免疫专业委员会学术会议论文集[C];2012年

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本文编号：803348