基于肿瘤多药耐药机制构建多孔微球和苯硼酸靶向型小核酸递释体系的研究

发布时间：2017-09-09 15:22

  本文关键词：基于肿瘤多药耐药机制构建多孔微球和苯硼酸靶向型小核酸递释体系的研究

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【摘要】：肿瘤多药耐药现象是肿瘤临床治疗中的主要屏障,会造成肿瘤细胞对化疗药物产生交叉耐药。多药耐药现象的机制十分复杂,主要是药物外排泵蛋白和抗凋亡蛋白在肿瘤细胞内的过表达所导致的。小核酸类药物,如si RNA和mi RNA能够有效针对胞内某种蛋白的表达进行靶向沉默,故而成为逆转多药耐药的理想工具。以多药耐药现象的分子机制为指导,设计构建高效的小核酸递释体系成为一项极具潜力的探索性研究。基于上述考虑,本论文首先以双功能PEG作为交联剂,将苯硼酸靶向基团连接到树枝状高分子材料PAMAM表面,设计构建了一种对肿瘤细胞具有特异性靶向功能的小核酸药物载体PPP。该载体具有良好的si RNA结合和保护能力,能够抵抗RNA酶和血清对si RNA分子的降解并有效促进Bcl-2 si RNA的胞吞进而提升转染效率。通过对Bcl-2基因表达的高效沉默,该递释体系显著提升了Hep G2细胞对阿霉素的药物敏感度,抑制了多药耐药现象的发生,最终介导了细胞凋亡从而实现对肿瘤细胞增殖的有效抑制。随后,为了提高化疗药物的生物利用度,我们以PLGA为材料,使用碳酸氢铵作为造孔剂,针对给药困难的肺部肿瘤设计构建了可吸入式化疗药物与小核酸共载的多孔空心微球递释体系。该多孔空心PLGA微球展现了对阿霉素和mi R-519c良好的包载率和稳定的缓释作用。通过增殖抑制、细胞凋亡和周期阻滞等细胞生物学水平的检测,共载微球释放液对肺癌细胞A549具有显著的增殖抑制和杀伤效果,并展示了良好的药物与基因协同作用效果。胞内阿霉素浓度的检测显示,mi R-519c的引入能够有效抑制ABCG2对阿霉素的外排作用,提高胞内阿霉素的浓度,抑制多药耐药现象的产生。综上,以肿瘤多药耐药机制为指导的小核酸递释体系能够有效实现药物与基因的递送,通过抑制多药耐药现象的发生极大地提高了对肿瘤细胞的抑制和杀伤效果。以上研究,为构建针对肿瘤多药耐药的药物与基因递释体系提供了新的策略和方法,证明了药物与基因递释体系在肿瘤治疗领域的巨大潜力,为未来的临床应用奠定了良好的基础。
【关键词】：多药耐药 小核酸 基因治疗 靶向递送 共递送
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 绪论12-32
• 1.1 肿瘤耐药机制的形成及相关关键基因13-21
• 1.1.1 肿瘤耐药机制的形成13-15
• 1.1.2 肿瘤耐药机制相关关键基因15-21
• 1.2 递释体系在逆转肿瘤多药耐药中的应用21-25
• 1.2.1 MDR蛋白抑制剂的递释体系22-23
• 1.2.2 靶向MDR蛋白的小核酸药物递释体系23-24
• 1.2.3 调控药物摄取途径的纳米粒子递释体系24-25
• 1.3 药物与基因的协同作用及共递送体系25-30
• 1.3.1 脂质材料共递送体系26-27
• 1.3.2 树枝状高分子材料共递送体系27-29
• 1.3.3 聚合物材料共递送体系29-30
• 1.4 本课题研究思路30-32
• 第二章 苯硼酸靶向型PAMAM递送体系介导Bcl-2 siRNA与阿霉素共给药抑制肿瘤细胞增殖的研究32-57
• 2.1 引言32-33
• 2.2 实验材料33-35
• 2.2.1 细胞株33
• 2.2.2 小干扰RNA（siRNA）33
• 2.2.3 主要试剂33-34
• 2.2.4 实验器材34
• 2.2.5 主要溶液的配制34-35
• 2.3 实验方法35-41
• 2.3.1 细胞培养35-36
• 2.3.2 苯硼酸修饰PAMAM的合成与表征36-37
• 2.3.3 ICP-MS硼元素检测37
• 2.3.4 凝胶电泳分析37
• 2.3.5 细胞毒性分析37-38
• 2.3.6 流式细胞术分析38
• 2.3.7 激光共聚焦显微镜分析38
• 2.3.8 唾液酸抗原表达水平检测38
• 2.3.9 反转录 PCR（RT-PCR）和反转录定量 PCR（q RT-PCR）38-39
• 2.3.10 蛋白质印记检测39-40
• 2.3.11 Bcl-2 siRNA转染抑制肿瘤细胞增殖40
• 2.3.12 Bcl-2 siRNA转染介导肿瘤细胞凋亡40
• 2.3.13 Live/Dead细胞染色40
• 2.3.14 数据的统计学分析40-41
• 2.4 实验结果与讨论41-55
• 2.4.1 PPP载体的合成与表征41-46
• 2.4.2 PPP/siRNA纳米粒子的胞吞行为研究46-51
• 2.4.3 PPP/siRNA纳米粒子靶向沉默Bcl-2 基因51-52
• 2.4.4 PPP/siRNA纳米粒子抑制肿瘤细胞增殖52-55
• 2.5 本章小结55-57
• 第三章 可吸入式多孔空心PLGA微球药物与基因共递送体系的构建与评价57-79
• 3.1 引言57-58
• 3.2 实验材料58-59
• 3.2.1 质粒与细胞株58
• 3.2.2 主要试剂58-59
• 3.2.3 实验仪器59
• 3.2.4 主要试剂的配制59
• 3.3 实验方法59-64
• 3.3.1 细胞培养59
• 3.3.2 pcDNA-miR-519c质粒提取59
• 3.3.3 多孔空心PLGA微球的制备59-60
• 3.3.4 多孔空心PLGA微球的表征60
• 3.3.5 多孔空心PLGA微球的载药量和包封率测定60-61
• 3.3.6 微球体外药物释放61
• 3.3.7 微球释放液抑制肿瘤细胞增殖61-62
• 3.3.8 微球释放液诱导肿瘤细胞凋亡62
• 3.3.9 微球释放液诱导肿瘤细胞周期阻滞62-63
• 3.3.10 微球释放液诱导肿瘤细胞相关蛋白表达量变化63
• 3.3.11 微球释放液诱导肿瘤细胞Caspase家族蛋白活性变化63
• 3.3.12 微球释放液促进阿霉素在肿瘤细胞中的富集63-64
• 3.3.13 数据的统计学分析64
• 3.4 实验结果与讨论64-78
• 3.4.1 多孔空心PLGA微球的制备与表征64-69
• 3.4.2 微球释放液抑制肿瘤细胞增殖69-71
• 3.4.3 微球释放液诱导A549细胞周期阻滞及凋亡71-74
• 3.4.4 微球释放液抑制A549细胞的分子机制研究74-75
• 3.4.5 药物与基因共递送体系影响阿霉素的胞内富集75-78
• 3.5 本章小结78-79
• 全文总结79-81
• 参考文献81-91
• 硕士期间的科研成果与奖励91-93
• 致谢93

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