人结肠癌细胞GOLPH3基因与Wnt信号通路的相关性研究

发布时间：2017-09-10 00:01

  本文关键词：人结肠癌细胞GOLPH3基因与Wnt信号通路的相关性研究

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【摘要】：目的:结直肠癌组织中GOLPH3过表达可促进癌细胞增殖,其机制与激活PI3K/Akt/m TOR信号通路相关,本实验通过对GOLPH3基因与Wnt信号通路活性的相关性进行研究,探讨GOLPH3基因过表达促进结肠癌细胞增殖的相关机制。方法:1、RT-PCR检测HCT116、HT29、SW480及SW620四种人结肠癌细胞中GOLPH3 m RNA的表达情况,选择表达水平最高的人结肠癌细胞株继续进行分组实验。2、将人结肠癌SW620细胞株分为四个组:对照组、si RNA-GOLPH3转染组、加Akt抑制剂Tricinbine组及加GSK-3β抑制剂TWS119组。3、RT-PCR方法检测结肠癌SW620细胞转染si RNA-GOLPH3后的沉默效果。4、通过Topflash报告基因活性检测各组结肠癌SW620细胞Wnt信号通路的活性。5、应用MTT法、平板克隆形成实验检测各组结肠癌SW620细胞的增殖情况。6、利用流式细胞技术检测各组结肠癌SW620细胞的凋亡率。7、Western Blot检测各组结肠癌细胞中GOLPH3、β-catenin、GSK-3β、p S9-GSK-3β蛋白的表达。8、统计学分析各组实验结果,探讨GOLPH3基因过表达通过激活Wnt信号通路促进结肠癌细胞增殖的相关性。结果:1、RT-PCR法检测四种人结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480及SW620中GOLPH3 m RNA的表达水平(1.00±0.097)、(2.872±0.064)、(1.957±0.133)与(3.958±0.169)。GOLPH3 m RNA在结肠癌SW620细胞株中表达水平最高,选择人结肠癌细胞株SW620进行后续的分组实验。2、人结肠癌细胞株SW620组和转染组细胞GOLPH3 m RNA的表达水平分别为(1.000±0.092)和(0.236±0.076),转染组表达水平显著性低于对照组(P0.001),转染效果良好。3、对照组与三个实验组(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)SW620癌细胞的相对荧光素酶活性(Relative Luciferase Activity),即相对RLU值分别为(1.000±0.164)与(0.342±0.061)、(0.359±0.125)、(0.365±0.155),三个实验组癌细胞的相对RLU值均明显低于对照组(P0.01),并且各实验组间相互对比,癌细胞的RLU值无显著差别(P0.05)。4、MTT法检测对照组与三个实验组(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)癌细胞的生长抑制率分别为0与59.9%、56.6%、51.3%,各实验组癌细胞的生长抑制率均高于对照组(P0.05),同时各实验组间互相对比,癌细胞的生长抑制情况无明显差异(P0.05)。5、平板克隆形成实验检测对照组及三个实验组(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)SW620癌细胞的集落数分别为(207.333±17.786)、(82.333±15.144)、(93.333±12.342)、(95.667±16.563),各实验组癌细胞集落数均显著低于对照组(P0.001),在各实验组间的比较显示癌细胞的克隆能力无差异性(P0.05)。6、对照组与三个实验组(si RNA-GOLPH3;加Tricinbine;加TWS119)SW620癌细胞的凋亡率分别为(1.680±0.576)%与(52.467±4.373)%、(46.167±5.293)%、(50.167±6.506)%,实验组癌细胞的凋亡比例均显著性增加(P0.001),且各实验组间互相比较显示癌细胞的凋亡情况差异无统计学意义(P0.05)。7、Western Blot检测结果:与对照组比较:①在si RNA-GOLPH3组:癌细胞GOLPH3蛋白表达明显下降(P0.001),β-catenin蛋白表达明显降低(P0.001),GSK-3β蛋白表达无差别(P0.05),p S9-GSK3β蛋白表达明显降低(P0.001);②加Tricinbine组:GOLPH3蛋白表达无差异(P0.05),β-catenin蛋白表达明显降低(P0.001),GSK-3β蛋白表达无差异(P0.05),p S9-GSK3β蛋白表达明显降低(P0.001);③加TWS119组:GOLPH3蛋白表达无差别(P0.05),β-catenin蛋白表达显著降低(P0.001),GSK-3β蛋白表达无差异(P0.05),p S9-GSK3β蛋白表达显著下降(P0.001)。各实验组比较:①GOLPH3蛋白的表达在si RNA-GOLPH3组低于加Tricinbine组及加TWS119组(P0.05),并且后两组间表达无差异性(P0.05);②在si RNA-GOLPH3组及加Tricinbine组中β-catenin蛋白的表达无差别(P0.05),但均低于加TWS119组的表达(P0.05);③GSK-3β蛋白及p S9-GSK3β蛋白在各实验组中的表达的差异无统计学意义(P0.05)。结论:1、GOLPH3基因过表达可激活Wnt信号通路,上调β-catenin表达,促进结肠癌细胞增殖,抑制凋亡;2、Akt、GSK3β活化可开启Wnt信号通路,上调β-catenin表达,促进结肠癌细胞增殖,抑制凋亡;3、GOLPH3基因过表达可激活Wnt信号通路,其机制是GOLPH3过表达可激活Akt,并进一步通过GSK3β介导细胞内Wnt信号通路的激活,促进结肠癌细胞的增殖。
【关键词】：人结肠癌细胞株 GOLPH3 Wnt信号通路 Akt GSK-3β β-catenin
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-26
• 1. 材料15-17
• 1.1 细胞株15
• 1.2 主要试剂15-16
• 1.3 主要仪器16-17
• 1.4 主要溶剂的配置17
• 2. 方法17-26
• 2.1 RT-PCR 方法检测四种人结肠癌细胞中 GOLPH3 m RNA 的表达，，选择高表达的癌细胞株分组实验17-20
• 2.2 筛选、分组20-21
• 2.3 Wnt信号通路活性的测定21
• 2.4 MTT法检测各组结肠癌SW620细胞的增殖21-22
• 2.5 平板克隆形成实验22
• 2.6 流式细胞仪检测各组结肠癌SW620细胞的凋亡22-23
• 2.7 Western Blot 检测各组 SW620 结肠癌细胞内 GOLPH3、β-catenin、GSK-3β、p S9-GSK3β蛋白的表达23-25
• 2.8 统计学分析25-26
• 结果26-34
• 1. GOLPH3 m RNA在四种人结肠癌细胞株中的表达26
• 2. 结肠癌SW620细胞si RNA转染26-27
• 3. 各实验组结肠癌SW620细胞Wnt信号通路活性的检测27-28
• 4. 各实验组结肠癌SW620细胞增殖能力的检测28-29
• 5. 各实验组结肠癌SW620细胞的克隆情况29-30
• 6. 各实验组结肠癌SW620细胞的凋亡率30-32
• 7. 各组结肠癌SW620细胞GOLPH3、β-catenin、GSK-3β及p S9-GSK3β蛋白的表达32-34
• 讨论34-39
• 结论39-40
• 参考文献40-45
• 综述45-64
• 参考文献55-64
• 致谢64

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本文编号：823531