CD44启动子对结直肠癌CD44阳性表达调控机制的研究

发布时间：2017-09-13 17:09

  本文关键词：CD44启动子对结直肠癌CD44阳性表达调控机制的研究

  更多相关文章： CD44启动子 DNA结合蛋白 结直肠癌 电泳迁移率改变分析

【摘要】：目的：CD44异常表达是结直肠癌形成及发展的重要因素。CD44作为细胞黏附分子,在结直肠癌中表达,可介导及参与肿瘤的生成及转移。鉴于CD44表达在结直肠癌发生、发展过程中的重要作用,研究结直肠癌中CD44的表达调控机制对揭示结直肠癌的发生发展机理及防治肿瘤复发转移有着重要意义。但目前对结直肠癌CD44异常表达调控的研究报道甚少。本研究通过检测分析CD44启动子DNA结合蛋白对结直肠癌CD44表达的调控作用,探讨CD44启动子与结合蛋白的相关作用,并寻找在其中发挥调控作用的蛋白或蛋白群,从而在转录水平查证CD44启动子结合蛋白对CD44表达的激活和调控作用以及对结直肠癌生物学行为的影响,为揭示结直肠癌的发生发展机理及复发转移的防治奠定基础,也为结直肠癌的基因治疗提供实验依据以及潜在的治疗靶点。方法：CD44启动子甲基化验证：分别从阴性和阳性淋巴细胞和LOVO(人结肠癌细胞)细胞中提取基因组DNA提取→亚硫酸氢盐处理→BSP引物设计合成→PCR扩增→PCR产物纯化→PCR产物测序→BSP测序结果可视化分析将从人 HMLE (immortalized human mammary epithelial cells,永生化乳腺上皮细胞)细胞中抽提的染色体DNA在上、下游引物的5’端酶切位点分别插入NheI和XhoI限制性内切酶。结果片段克隆到pGL3荧光素酶标记低拷贝非病毒克隆载体载体并测序。采用PCR技术扩增CD44启动子。将细菌质粒在LB培养基过夜培养后使用小提质粒试剂盒提取质粒DNA,并采用琼脂糖凝胶电泳检测其活性以及条带位置。根据其引入的双限制性内切酶识别位点使用限制性内切酶NheI和XhoI进行双酶切并采用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因条带位置。将酶切得到的目的基因通过琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化,并使用3’末端生物素标记试剂盒标记回收得到的质粒DNA,并检测验证标记效率。将冻存的colo-320(人结肠腺癌细胞)大量培养后加入CD44抗体进行流式细胞分选术,检测阳性率：提取核蛋白。将回收并标记的质粒DNA与提取的核蛋白进行电泳凝胶迁移率改变实验(EMSA)4,检测质粒DNA与核蛋白结合情况。并将目的条带质谱测序分析蛋白质成分。结果：1.BSP测序结果可视化分析得出：4个样品在CD44基因外显子1(含外显子1)上游大概2000bp序列上未发生甲基化,没有甲基化的位点。2.自质粒载体CD44promoter pGL3中提取的CD44启动子质粒DNA与目的条带一致,位于4148bp。3.使用限制性内切酶Nh e I、X h o I双酶切CD44启动子质粒DNA与目的条带一致,位于2000bp。4.回收得到双酶切后的CD44启动子质粒DNA与目的条带一致,位于2000bp。5.3’末端生物素成功标记回收得到的CD44启动子质粒DNA。6.EMSA电泳显示CD44启动子质粒DNA与colo-320CD44+细胞核蛋白结合的反应组较其他两组移动的慢,表明CD44启动子质粒与colo-320CD44+细胞核蛋白成功结合。7.质谱分析得出：蛋白得分21分,成功鉴定,可靠性达到显著水平。测序结果证实,在核蛋白中至少有30个蛋白参与了转录,经综合分析,较重要的有Serum albumin(血清白蛋白)、I3L1U9 HUMAN(肌动蛋白,n断)、POTE ankyrin domain family member(POTE锚蛋白、Keratin, type I cytoskeletal 10(角蛋白,1型上皮细胞)、K22E HUMAN(角蛋白,2型上皮细胞骨架)。结论：1.结直肠癌中CD44异常表达不是通过启动子甲基化调控的。2.结直肠癌CD44异常表达是通过CD44启动子结合相关蛋白调控的。3.白蛋白-组蛋白复合体可激活CD44基因转录,导致结直肠癌中CD44异常表达；锚蛋白与CD44启动子结合相互作用,是促进结直肠癌CD44异常表达的重要因素；肌动蛋白和角蛋白与CD44相互作用促进结直肠癌增殖、浸润和转移。4.结直肠癌CD44表达调控有待深入研究,对临床有重要意义。
【关键词】：CD44启动子 DNA结合蛋白 结直肠癌 电泳迁移率改变分析
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-31
• 2.1 探针制备14-19
• 2.2 探针标记19-21
• 2.3 探针标记灵敏度检测21-22
• 2.4 细胞培养22-24
• 2.5 核蛋白提取24-25
• 2.6 CD44启动子甲基化验证25-27
• 2.7 EMSA电泳迁移率实验27-29
• 2.8 盐桥法转膜29-31
• 2.9 EMSA凝胶质谱测序由蛋白质中心完成31
• 结果31-60
• 3.1 细菌培养及质粒扩X，
  
  本文编号：844953
  suoshi