Gli-2在膀胱癌中的表达和意义及对T24细胞VEGF和MMP-9表达的影响

发布时间：2017-09-15 00:33

  本文关键词：Gli-2在膀胱癌中的表达和意义及对T24细胞VEGF和MMP-9表达的影响

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【摘要】：目的:通过检测Hedgehog信号通路关键基因Gli-2蛋白在膀胱癌组织中的表达,研究其与膀胱癌临床病理特征之间的关系;探讨Gli-2在膀胱癌T24细胞增殖中的作用及其机制,以及对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达的影响。方法:(1)应用免疫组织化学方法检测77例膀胱癌组织中Gli-2的表达。(2)应用小干扰RNA(siRNA)下调Gli-2在膀胱癌T24细胞系中的表达,分别提取总RNA和蛋白质。使用RT-PCR方法检测Gli-2的mRNA表达,Western-blot方法分析Gli-2,VEGF和MMP-9蛋白的表达。分别应用CCK-8法和流式细胞术检测下调Gli-2表达对细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:(1)在77例膀胱癌中,77例均有不同程度的Gli-2阳性表达,阳性率为100.0%。Gli-2的表达与病理分期密切相关,随病理分期的升高,评分亦高(P0.001),且在肌层浸润性膀胱癌中的表达明显高于非肌层浸润性膀胱癌(P0.001),Gli-2的表达与病理分级不相关,两者仅有边缘性意义(P=0.052)。(2)在T24细胞中应用siRNA沉默Gli-2表达后,实验组细胞的Gli-2基因的mRNA表达水平明显下降,与对照组相比差异有统计学意义(t=-3.031,P0.05)。Gli-2蛋白的表达明显下调。此外,VEGF和MMP-9蛋白的表达较对照组均降低。CCK-8法检测结果显示实验组细胞增殖被显著抑制,其P值均0.001。流式细胞仪检测RNA干扰后48h的细胞周期情况,发现实验组有(27.8±2.1)%的细胞被阻滞于G2/M期,而对照组G2/M期细胞只有(6.61±1.1)%,差异有统计学意义(P0.05)。Gli-2基因表达被沉默后,T24细胞细胞凋亡率为(11.63±1.09)%,较对照组(3.43±1.05)%显著升高,凋亡增加,差异有统计学意义(t=4.015,P0.05)。结论:Gli-2蛋白在膀胱癌组织中的表达与病理分期密切相关,且在肌层浸润性膀胱癌中表达明显升高。抑制Gli-2的表达可抑制膀胱癌细胞增殖,诱导凋亡,提示Gli-2参与了膀胱癌的发生发展,有可能成为新的膀胱癌的治疗靶点。
【关键词】：膀胱癌 Gli-2基因 VEGF MMP-9 细胞增殖
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 引言9-12
• 第一章 材料及方法12-25
• 1.1 实验材料12-15
• 1.1.1 研究对象12
• 1.1.2 细胞来源12
• 1.1.3 主要试剂12-14
• 1.1.4 主要器材、仪器14-15
• 1.2 实验方法15-25
• 1.2.1 免疫组化染色15-16
• 1.2.1.1 石蜡切片的制作15
• 1.2.1.2 免疫组化SP法15-16
• 1.2.1.3 结果分析与判断16
• 1.2.2 细胞培养16-18
• 1.2.2.1 细胞复苏16-17
• 1.2.2.2 细胞培养17
• 1.2.2.3 细胞传代17
• 1.2.2.4 细胞冻存17-18
• 1.2.3 实验分组及siRNA转染18
• 1.2.3.1 实验分组18
• 1.2.3.2 siRNA转染18
• 1.2.4 RT-PCR方法检测实验组和对照组T24细胞内Gli-2 的mRNA表达18-20
• 1.2.4.1 膀胱癌T24细胞总RNA提取18-19
• 1.2.4.2 逆转录19-20
• 1.2.4.3 Gli-2 编码序列引物的设计20
• 1.2.4.4 Real time PCR扩增Gli-2 编码序列20
• 1.2.5 Western-blot方法分析Gli-2，VEGF和MMP-9 蛋白的表达20-23
• 1.2.5.1 细胞蛋白样品的制备21
• 1.2.5.2 蛋白浓度的测定21
• 1.2.5.3 Western blot检测蛋白表达21-23
• 1.2.6 CCK-8 法检测T24细胞增殖情况23
• 1.2.7 细胞周期和凋亡的检测23-24
• 1.2.8 统计分析24-25
• 第二章 实验结果25-34
• 2.1 免疫组化检测结果25-27
• 2.2 Gli-2 膀胱癌细胞株中的表达及意义27-28
• 2.3 . 小干扰 RNA 沉默 Gli-2 基因效果的验证28-29
• 2.4 实验组和对照组 T24 细胞内 Gli-2 的 m RNA 表达情况29-30
• 2.5 实验组和对照组 T24 细胞中 Gli-2，VEGF 和 MMP-9 蛋白的表达情况30-31
• 2.6 实验组和对照组膀胱癌 T24 细胞的增殖情况31-32
• 2.7 Gli-2 基因表达下调对膀胱癌 T24 细胞的细胞周期和凋亡的影响32-34
• 第三章 讨论34-36
• 第四章 结论36-37
• 参考文献37-40
• 综述40-51
• 综述的参考文献46-51
• 攻读学位期间的研究成果51-52
• 致谢52-53

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