组蛋白甲基转移酶EZH2在力达霉素等药物诱导人结肠癌细胞衰老中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-15 01:08

  本文关键词：组蛋白甲基转移酶EZH2在力达霉素等药物诱导人结肠癌细胞衰老中的作用及机制研究

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【摘要】：背景和目的：结肠癌(Colon cancer)是世界第三大恶性肿瘤,具有很高的发病率及死亡率。肿瘤发生的主要事件是肿瘤细胞逃逸衰老和死亡程序而进入永生化,因此诱导肿瘤细胞重获衰老特征及诱导细胞凋亡是抑制肿瘤生长和增殖的重要途径。越来越多的研究证明,表观遗传调控在结肠癌的发生发展中起着重要的作用。组蛋白甲基转移酶EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2)是表观遗传调控蛋白PRC2家族的核心成员,通过三甲基化H3K27 (H3K27me3)进而发挥对靶基因的转录沉默作用。细胞衰老是公认的抗肿瘤作用机制之一,研究发现,抑制EZH2的表达能够诱导肿瘤细胞衰老,然而,EZH2在烯二炔类DNA损伤药物诱导的结肠癌细胞衰老中的作用至今尚不清楚。本研究选用人结肠癌细胞作为研究对象,拟用高效抗肿瘤烯二炔药物力达霉素(Lidamycin, LDM)观察其对结肠癌细胞中EZH2的表达是否有影响,以及EZH2在力达霉素诱导细胞衰老中的作用及机制。在此基础上,本研究还采用EZH2抑制剂DZNep作用结肠癌细胞来观察DZNep能否诱导结肠癌细胞衰老。方法：MTT法、细胞生长曲线测定及克隆形成实验法检测上述药物对结肠癌细胞增殖活力及克隆形成能力的影响；SA-β-Gal染色检测细胞衰老表型；PI染色结合流式细胞术检测细胞周期分布；Annexin Ⅴ Alexa Fluor488/PI双染结合流式细胞术检测凋亡细胞比例；双荧光素酶报告基因检测p21启动子区的活性；蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测各蛋白水平和mRNA水平的变化；流式细胞术检测DNA损伤标志物γ-H2AX的含量变化；免疫组化实验检测人结肠癌组织样本中EZH2和细胞衰老相关蛋白p21的表达；siRNA敲低EZH2表达以及构建慢病毒表达载体过表达EZH2,检测其对LDM所致细胞增殖、周期及衰老作用的影响。siRNA敲低p21表达,检测对LDM诱导细胞周期、细胞凋亡及细胞衰老作用的影响。染色质免疫共沉淀实验检测EZH2蛋白与p21启动子区的结合作用。结果：一、EZH2与LDM诱导人结肠癌细胞衰老的关系研究LDM对HCT116和SW620细胞有明显抑制增殖活力及克隆形成能力的作用。SA-β-Gal染色观察到IC50浓度范围(0.5 nM) LDM作用48 h-120 h可以明显诱导HCT116和SW620细胞发生细胞衰老,并且该衰老样表型具有不可逆性。0.5 nMLDM作用时间依赖性诱导细胞G2/M期周期阻滞及细胞凋亡,同时DNA损伤标志物y-H2AX含量明显增加。LDM可明显抑制H3K2、H3K27me3及PRC2成员蛋白的表达水平并上调衰老相关蛋白p21的表达水平,其中对EZH2、H3K27me3及PRC2成员蛋白的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性；LDM对EZH2蛋白表达的抑制作用与其mRNA水平变化有关。双荧光素酶报告基因检测发现LDM可显著增加p21启动子区的活性。siRNA敲低EZH2表达后可诱导上述细胞发生衰老及G2/M细胞周期阻滞等类似现象。免疫组化结果显示EZH2在人结肠癌癌组织中的表达普遍高于癌旁组织。通过在HCT1 16细胞中过表达EZH2, LDM对p21启动子的激活作用和p21蛋白表达上调作用均受到抑制,DNA损伤标志物γ-H2AX含量下降。siRNA敲低p21的表达可显著逆转LDM诱导的细胞衰老。染色质免疫共沉淀结果显示,LDM作用SW620细胞72 h后能够显著降低EZH2及H3K27me3在p21启动子区的富集。二、DZNep诱导人结肠癌细胞HCT116细胞衰老的机制研究DZNep在IC50范围内(5μM)对HCT116细胞有明显抑制增殖活力及克隆形成能力的作用。SA-β-Gal染色观察到DZNep (5μM)作用48h-120h能够诱导细胞衰老,同时通过siRNA干扰EZH2的表达也能观察到衰老染色阳性细胞。5μMDZNep作用24 h-72 h能够诱导细胞G2/M周期阻滞及细胞凋亡。DZNep作用48h-120 h能够时间依赖性抑制EZH2、EED、SUZ12蛋白表达,上调细胞周期调控蛋白p21、p27蛋白表达,并下调p-RB和p-cdc2蛋白的表达。Western Blot检测到凋亡标志蛋白PARP切割。结论：本研究中,我们首次发现在结肠癌细胞中LDM能够抑制EZH2及其他PRC2家族成员以及甲基化组蛋白H3K27me3的表达,证明了LDM通过抑制EZH2的表达,解除对p21启动子区的抑制作用并上调p21蛋白的表达,激活细胞衰老信号通路进而诱导结肠癌细胞衰老。而在EZH2抑制剂DZNep抑制结肠癌生长增殖的作用机制研究中,我们首次发现了DZNep能够诱导结肠癌细胞衰老。本研究首次为EZH2与烯二炔抗肿瘤抗生素诱导结肠癌细胞衰老之间的表观遗传调控机制提供了证据,并为以EZH2为靶点进行抗结肠癌治疗提供了新思路。
【关键词】：结肠癌 细胞衰老 LDM EZH2 DZNep 抗肿瘤
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略语10-12
• 第一部分：EZH2与LDM诱导人结肠癌细胞衰老的关系研究12-58
• 前言12-15
• 材料与方法15-26
• 实验结果与分析26-48
• 1. EZH2基因在人结肠癌组织及结肠癌细胞系中的表达情况26-28
• 1.1 EZH2在人结肠癌组织中的表达情况26-27
• 1.2 EZH2在结肠癌患者中的生存期分析27
• 1.3 EZH2在人结肠癌细胞系中的表达情况27-28
• 2. LDM对EZH2及PRC2家族成员的作用28-31
• 2.1 LDM在蛋白水平对EZH2及PRC2家族成员作用28-30
• 2.2 LDM在mRNA水平对EZH2的作用30
• 2.3 LDM在其他肿瘤细胞系对EZH2的作用30-31
• 3. LDM对人结肠癌细胞增殖的作用31-36
• 3.1 LDM对结肠癌细胞生长增殖的作用31-32
• 3.2 LDM对结肠癌细胞周期分布的影响32-34
• 3.3 LDM诱导结肠癌细胞凋亡34-35
• 3.4 LDM诱导结肠癌细胞衰老35-36
• 4. LDM诱导人结肠癌细胞衰老的机制研究36-39
• 4.1 LDM诱导细胞衰老的相关蛋白表达情况36
• 4.2 LDM不依赖p53蛋白诱导人结肠癌细胞衰老36-37
• 4.3 LDM诱导的结肠癌细胞衰老具有不可逆性37-39
• 5. EZH2在LDM诱导细胞衰老中的作用39-42
• 5.1 干扰EZH2的表达对结肠癌细胞衰老的影响39-40
• 5.2 过表达EZH2对LDM诱导细胞衰老的影响40-42
• 5.3 EZH2对LDM诱导细胞DNA损伤的影响42
• 6. EZH2参与LDM对p21调控的分子机制42-48
• 6.1 p21在人结肠癌组织中的表达情况43-44
• 6.2 LDM依赖p21信号通路诱导HCT116细胞衰老44-45
• 6.3 EZH2参与LDM对p21蛋白水平的调控45
• 6.4 EZH2参与LDM对p21启动子区的活性调节45-46
• 6.5 EZH2调控p21启动子区的组蛋白甲基化46-48
• 讨论48-52
• 参考文献52-57
• 论文结论57-58
• 第二部分：DZNep诱导人结肠癌细胞HCT116细胞衰老的机制研究58-71
• 前言58-60
• 材料与方法60-61
• 实验结果与分析61-66
• 1. DZNep对HCT116细胞的生长增殖抑制作用61-62
• 2. DZNep诱导HCT116细胞G1期周期阻滞62
• 3. DZNep诱导HCT116细胞衰老62-63
• 4. DZNep对HCT116细胞周期相关蛋白表达的影响63-64
• 5. DZNep诱导HCT116细胞凋亡64-66
• 讨论66-68
• 参考文献68-70
• 论文结论70-71
• 文献综述71-87
• 参考文献82-87
• 个人简历87-88
• 附录88-91
• 致谢91

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本文编号：853399