低剂量环磷酰胺对小鼠脾脏Treg细胞影响及联合CIK细胞治疗小鼠肝癌的研究

发布时间：2017-09-17 08:36

  本文关键词：低剂量环磷酰胺对小鼠脾脏Treg细胞影响及联合CIK细胞治疗小鼠肝癌的研究

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【摘要】：目的通过研究单次和循环应用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)对荷瘤小鼠调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的影响及联合细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIKs)抗肿瘤的疗效,初步探讨环磷酰胺增强过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)肿瘤的机制,为提高ACI抗肿瘤疗效提供思路。方法体内动物实验以C57BL/6小鼠为研究对象,培养Hepa1-6小鼠肝癌细胞,注射于小鼠右侧腋下建立小鼠肝癌皮下模型。观察CTX对脾脏Tregs影响的实验中将造模成功的小鼠随机分为4组,每组40只小鼠,分别为正常小鼠组,单纯荷瘤小鼠组,单次应用CTX组,循环应用CTX组。每组分别用相应治疗方案干预后获取小鼠脾脏单细胞悬液,流式细胞术检测CD4+CD25+FoxP3+/CD4+T细胞比例,隔天测量小鼠肿瘤长短径,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。体外培养CIKs实验将小鼠脾脏制成单细胞悬液,密度梯度离心法获得脾脏单个核细胞做为培养CIKs的前体细胞,在体外经干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、抗CD3e单克隆抗体(Anti CD3e monoclonal antibodies,anti-CD3Mab)、白介素-2(interlukin-2,IL-2)刺激,培养过程中绘制细胞增殖曲线,培养结束时用流式细胞术检测CIKs中的主要效应细胞表型CD8+NK1.1+的含量,CCK-8法检测CIKs对Hepa1-6肝癌细胞的杀伤活性。CTX联合CIKs治疗小鼠肝癌的实验中,将造模成功的荷瘤小鼠随机分为6组,每组5只,分别为单纯荷瘤组,单次CTX治疗组,循环CTX治疗组,单纯CIKs治疗组,单次CTX+CIKs治疗组,循环CTX+CIKs治疗组,每组分别用相应治疗方案干预后,隔天测量小鼠肿瘤长短径,计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线,实验结束时,剥离瘤块称重,计算抑瘤率。结果在CTX对脾脏Tregs影响实验,未经CTX治疗组的荷瘤小鼠脾脏Tregs比例随时间延长逐渐增加;单次CTX治疗组Tregs比例出现短暂的降低,随后恢复到初始水平并持续升高;循环CTX组Tregs维持在较低水平。实验结束未经治疗的荷瘤小鼠、单次CTX、循环CTX治疗组小鼠肿瘤体积分别为4056.5±865.4 mm3、3517.9±756.5 mm3、2256.4±620.3 mm3,单次CTX组与单独荷瘤组肿瘤体积比较无差异(P0.05),循环CTX组体积明显小于单独荷瘤组(P0.01)。体外培养CIKs实验中,经2周的培养,细胞总量增加14.4倍;CD8+NK1.1+双阳性细胞的比例有由最初的0.7±0.3%增加到17.7±2.3%;在对Hepa1-6细胞的杀伤活性,效靶比为10:1、20:1、40:1时杀伤活性分别为25.99±3.53%、38.26±3.65%、54.77±5.35%。在CTX联合CIKs治疗小鼠肝癌实验,实验结束时单次CTX治疗组肿瘤体积与荷瘤对照组肿瘤体积无明显差异(3764.8±537.7 vs 3800.4±605.5 mm3,P=0.784);单独CIKs小于荷瘤对照组(3352.2±485.4 vs 3800.4±605.5 mm3,P=0.02);循环CTX明显小于单次CTX组(2076.6±620.2 vs 3764.8±537.7 mm3,P0.001);单次CTX+CIKs组明显小于单次CTX组(1867.1±533.6 vs 3764.8±537.7 mm3,P0.001),还小于单独CIKs组(1867.1±533.6 vs 3352.2±485.4 mm3,P0.001);循环CTX+CIKs组明显小于循环CTX(970.7±135.3 vs 2076.6±620.2 mm3,P0.001)、单独CIKs组(970.7±135.3 vs 3352.2±485.4 mm3,P0.001),还小于单独CTX+CIKs组(970.7±135.3 vs 1867.1±533.6 mm3,P0.001)。后期单独CTX或单独CIKs治疗组肿瘤体积迅速增加,而CTX和CIKs联合治疗组肿瘤体积保持平缓上升趋势。实验结束单次CTX治疗组,单独CIKs治疗组,循环CTX治疗组,单次CTX+CIKs治疗组,循环CTX+CIKs治疗组5组抑瘤率分别为3.7%、5.2%、48.1%、54.4%、78.6%。结论随着肿瘤发展,小鼠脾脏中Tregs比例逐渐增加;循环应用CTX能够使Tregs在较长时间内维持在相对较低水平,一定程度上抑制肿瘤生长,因此在临床应用中更有价值;用小鼠细胞因子IFN-γ、IL-2和小鼠Anti-CD3Mab刺激小鼠脾脏单个核细胞可成功培养出C57BL/6小鼠的CIKs,为相关动物实验的设计提供基础;低剂量CTX通过调控Tregs,能显著提高CIKs的疗效,以循环应用CTX效果最好,为CTX调控Tregs的基础上联合过继性免疫细胞治疗的临床应用提供理论依据。
【关键词】：环磷酰胺 肝细胞癌 调节性T细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 免疫治疗
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 第一章 背景回顾11-22
• 1 肝癌11-13
• 1.1 流行病学资料11
• 1.2 治疗方案11-13
• 2 细胞因子诱导的杀伤细胞13-16
• 2.1 概述13-14
• 2.2 抗肿瘤机制14
• 2.3 动物实验及临床应用14-16
• 3 调节性T细胞16-19
• 3.1 概述16
• 3.2 抑制肿瘤免疫的机制16-17
• 3.3 控制调节性T细胞的方案17-18
• 3.4 临床相关性18-19
• 4 环磷酰胺19-22
• 4.1 概述19
• 4.2 对调节性T细胞的调节19-20
• 4.3 对效应T细胞的调节20-21
• 4.4 动物实验及临床应用21-22
• 第二章 实验研究22-43
• 研究一 环磷酰胺对小鼠脾脏调节性T细胞的影响22-32
• 1 实验材料22-23
• 1.1 肿瘤细胞株和动物22
• 1.2 主要试剂材料22
• 1.3 主要仪器22-23
• 1.4 溶液配制23
• 2 实验方法23-26
• 2.1 肝癌细胞培养23-24
• 2.2 肝癌荷瘤鼠模型的制备24-25
• 2.3 分组及干预25
• 2.4 小鼠脾脏淋巴细胞检测25-26
• 2.5 观察小鼠肿瘤体积变化26
• 2.6 统计学方法26
• 3 实验结果26-29
• 3.1 Hepa1-6 肝癌细胞形态观察26
• 3.2 小鼠脾脏CD4~+CD25~+Foxp3~+/CD4~+比值的动态变化26-27
• 3.3 小鼠肿瘤体积观察27
• 附图27-29
• 4 讨论29-32
• 研究二 环磷酰胺联合CIK治疗小鼠肝癌模型疗效的研究32-43
• 1 实验材料32-34
• 1.1 肿瘤细胞和动物32
• 1.2 试剂和药物32
• 1.3 主要仪器32-33
• 1.4 溶液配制33-34
• 2 实验方法34-36
• 2.1 肝癌细胞培养34
• 2.2 建立小鼠肝癌模型34
• 2.3 小鼠脾脏CIK细胞的培养及功能检测34-35
• 2.4 分组及干预35-36
• 2.5 观察小鼠肿瘤体积变化36
• 2.6 剥出瘤块称重并计算抑瘤率36
• 2.7 统计学方法36
• 3 实验结果36-40
• 3.1 肝癌Hepa1-6 细胞形态36
• 3.2 细胞因子诱导的杀伤细胞增殖动态观察36-37
• 3.3 培养前及培养后的细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤活性比较37
• 3.4 观察各治疗组肿瘤体积变化37
• 3.5 肿瘤质量及抑瘤率观察37-38
• 附图38-40
• 4 讨论40-43
• 第三章 结论43-44
• 参考文献44-53
• 在学期间的研究成果53-54
• 致谢54-55
• 中英文缩略词表55-57

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