纳米氧化石墨烯对肿瘤细胞迁移能力的影响及其机制的研究

发布时间：2017-09-17 21:34

  本文关键词：纳米氧化石墨烯对肿瘤细胞迁移能力的影响及其机制的研究

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【摘要】：癌症是严峻的世界性健康问题,我国每年的肿瘤致死病例占约所有死亡病例的1/4。转移是恶性肿瘤区别于良性肿瘤的重要的特征之一,也是恶性肿瘤难以根治的主要原因之一。肿瘤转移是一个复杂、多步、级联的过程。转移最开始,肿瘤细胞开始形成新的微血管网络,肿瘤细胞在原发器官发生侵袭,通过微血管网络脱离原发肿瘤,穿过细胞外基质和内皮细胞进入血管或淋巴管中,通过血源性或者淋巴性的传播,转移到靶器官并进行增殖。在转移过程中,细胞发生了形态和结构的改变,许多细胞因子也起到了重要作用,其中包括ICAM、VCAM、MMPs、 collagen等。EMT是指上皮细胞失去原本的上皮特征,转变为具有间质细胞细胞形态和特性的细胞。EMT过程存在于人体正常生理过程,参与胚胎的形成。许多研究表明,肿瘤在转移过程中,肿瘤细胞能够通过EMT过程转化为肿瘤干细胞,肿瘤干细胞能够促进肿瘤细胞发生转移；一些肿瘤上皮细胞通过EMT过程获得间质细胞的特性,侵袭和运动能力都得到了相应的提高,这些研究结果表明EMT在肿瘤迁移过程占据重要地位。伪足是细胞运动的重要结构,也是肿瘤细胞发生侵袭和迁移的基础。石墨烯是最薄的纳米材料,仅具有一个原子厚度,是许多纳米材料的基本构成单位。随着对石墨烯的深入研究,石墨烯已经成为了材料科学界的“超级明星”。石墨烯功能化是目前的研究热点,各种功能化的石墨烯已在光电材料、传感器和探测器、纳米催化剂等领域中。在生物医学领域,氧化石墨烯主要被用于药物载体系统和基因治疗等方面,但目前对其生物安全性和生物效应的研究仍处于初步阶段,关于氧化石墨烯与肿瘤转移的作用关系的研究工作仍很少。为了探讨氧化石墨烯对肿瘤细胞迁移能力的影响,本文设计方案并进行了一系列实验。1)细胞毒性实验。结果证实,10μg/mL氧化石墨烯不会对小鼠乳腺癌细胞4T1和黑色素瘤细胞B16细胞的活力产生显著影响。2)划痕损伤实验。分析实验结果发现,经10μg/mL氧化石墨烯处理过得4T1细胞迁移至划痕区的细胞数量要明显减少,证明氧化石墨烯对4T1细胞和B16细胞两种不同种类的肿瘤细胞的迁移能力都能起到较好的抑制作用。3)分子水平和蛋白水平上检测细胞发生的变化。本文对细胞迁移相关的基因和蛋白的表达进行了检测。结果发现,氧化石墨烯处理实验中,影响4T1细胞迁移的主要因素是ICAM和mmp3,而在B16细胞中主要的影响因素则是ICAM,其它的一些迁移相关基因和蛋白的表达量变化不明显。4)分子机制。通过RT-PCR和Western Blot实验检测10μg/mL氧化石墨烯处理实验中各信号通路的变化,结果发现氧化石墨烯能够抑制4T1细胞和B16细胞的ErK和NF-κB蛋白的磷酸化,进而影响信号通路下游蛋白的作用。5)检测EMT过程。使用TGF-β诱导EMT,再通过RT-PCR实验检测10μg/mL氧化石墨烯处理实验中,EMT Markers的变化。结果发现,TGF-β诱导mmp9 和 fibronectin上调的现象在加入氧化石墨烯后恢复到正常。说明氧化石墨烯对TGF-β诱导的肿瘤细胞EMT过程具有抑制作用。6)细胞骨架染色。用TGF-β和10μg/mL氧化石墨烯处理肿瘤细胞并通过罗丹明标记的鬼笔环肽对肿瘤细胞骨架进行染色,再用激光共聚焦显微镜拍照,分析结果发现,TGF-β能够诱导细胞骨架的组装和伪足的形成,4T1细胞中,加入氧化石墨烯细胞的伪足减少,TGF-β诱导产生的形变也恢复到正常形态；B16细胞自身伪足数不多,氧化石墨烯对其形态没有明显影响,能够抑制TGF-β对B16细胞的作用。综合以上实验结果,氧化石墨烯对肿瘤细胞的影响是多方面的,通过这些影响,氧化石墨烯才能更有效地实现对肿瘤细胞迁移的抑制。本工作在细胞水平上初步阐明了氧化石墨烯的生物安全性和生物效应,揭示氧化石墨烯抑制肿瘤细胞迁移的分子机制,为纳米技术改善肿瘤治疗效果的临床应用奠定了基础。
【关键词】：氧化石墨烯 肿瘤转移 肿瘤细胞迁移 EMT 细胞骨架
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 符号说明12-14
• 第一部分 前言14-24
• 1.1 肿瘤的侵袭和转移14-18
• 1.1.1 肿瘤转移14-16
• 1.1.2 影响肿瘤细胞迁移的细胞因子16
• 1.1.3 EMT简述16-17
• 1.1.4 细胞伪足与肿瘤转移17-18
• 1.2 肿瘤治疗现状18-19
• 1.3 纳米材料生物效应研究进展19-20
• 1.3.1 纳米材料简介19
• 1.3.2 纳米材料在生物医学领域的应用19-20
• 1.4 纳米石墨烯的生物学效应20-22
• 1.4.1 纳米石墨烯20-21
• 1.4.2 纳米石墨烯材料的生物效应21-22
• 1.4.3 纳米石墨烯材料的生物安全性22
• 1.5 本工作的目的和意义22-24
• 第二部分 材料与方法24-38
• 2.1 实验材料与仪器24-26
• 2.1.1 纳米材料24
• 2.1.2 实验对象24
• 2.1.3 药品、试剂24-26
• 2.2 实验方法26-38
• 2.2.1 试剂制备26-28
• 2.2.2 细胞培养28-29
• 2.2.3 细胞毒性实验29-31
• 2.2.4 细胞形态观察31
• 2.2.5 划痕损伤实验31
• 2.2.6 动物细胞总RNA提取31-33
• 2.2.7 实时定量RT-PCR检测基因表达水平33-34
• 2.2.8 Western Blot检测蛋白表达水平34-36
• 2.2.9 细胞骨架染色36-38
• 第三部分 结果与分析38-58
• 3.1 细胞毒性的检测38-41
• 3.1.1 CCK-8试剂盒检测氧化石墨烯对细胞活力的影响38-39
• 3.1.2 流式细胞术检测氧化石墨烯对细胞凋亡的影响39-41
• 3.2 光镜下细胞形态的变化41
• 3.3 氧化石墨烯对肿瘤细胞迁移能力的影响41-47
• 3.3.1 伤痕愈合(细胞划痕)实验42-44
• 3.3.2 细胞内迁移相关蛋白水平的变化44-45
• 3.3.3 细胞内迁移相关基因表达水平的变化45-47
• 3.4 氧化石墨烯对肿瘤细胞信号通路的影响47-52
• 3.4.1 分子水平上检测加入信号通路抑制剂后基因变化48-50
• 3.4.2 蛋白水平上检测信号通路蛋白磷酸化水平的变化50-52
• 3.5 氧化石墨烯对肿瘤细胞EMT过程的影响52-54
• 3.6 氧化石墨烯对肿瘤细胞骨架的影响54-58
• 第四部分 总结与讨论58-64
• 4.1 石墨烯在生物医学方面的应用58
• 4.2 氧化石墨烯对肿瘤细胞迁移的影响58-61
• 4.2.1 氧化石墨烯对细胞的毒性58
• 4.2.2 氧化石墨烯能够抑制肿瘤细胞的迁移58-59
• 4.2.3 氧化石墨烯影响不同肿瘤细胞迁移的因素不同59
• 4.2.4 氧化石墨烯对肿瘤细胞信号通路的影响59-60
• 4.2.5 肿瘤细胞EMT过程的变化60
• 4.2.6 肿瘤细胞骨架的改变60-61
• 4.2.7 总结61
• 4.3 不足61-62
• 4.3.1 分子机制62
• 4.3.2 氧化石墨烯对肿瘤细胞长期作用效果62
• 4.3.3 氧化石墨烯对生物机体的整体作用62
• 4.4 展望62-64
• 参考文献64-72
• 致谢72-73
• 学位论文评阅及答辩情况隶73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 吕祥;宋军芳;李柏;;COX-2与肝癌关系的研究进展[J];现代肿瘤医学;2009年04期

2 陈淑芹;金敬顺;陈霞;;肿瘤的综合治疗方法[J];医学信息(中旬刊);2011年02期

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本文编号：871486