HMGB1调控MDSCs分化参与乳腺癌发生的机制研究

发布时间：2017-09-18 06:07

  本文关键词：HMGB1调控MDSCs分化参与乳腺癌发生的机制研究

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【摘要】：目的:1.通过对乳腺癌中HMGB1表达量、MDSCs比例的检测,分析两者在乳腺癌中的关系。2.通过检测HMGB1、MDSCs之间的关系,研究HMGB1对MDSCs分化的影响及其潜在的分子机制。方法:1.分别从正常鼠、荷瘤鼠中分离出外周血、脾脏和肿瘤,流式细胞仪检测外周血、脾脏中MDSCs的比例,q RT-PCR和Western blotting法测定荷瘤鼠肿瘤中HMGB1、i NOS及ARG1的表达水平。2.分离正常小鼠的骨髓、脾脏,分为对照组、HMGB1组、GM-CSF+IL-6组、GM-CSF+IL-6+HMGB1组和GM-CSF+IL-6+HMGB1+ethyl pyruvate(EP)组进行体外刺激48h后,流式细胞仪检测MDSCs、DCs和巨噬细胞的比例。3.Western blot法检测0min、15min、30 min、60 min、90 min和120 min六个时间点细胞中ERK1/2、STAT3、NF-κB和P38 MAPK蛋白磷酸化水平的改变,骨髓细胞用PDTC、Niclosamide、SB203580、U0126预处理1h后,再加入HMGB1重组蛋白刺激,流式细胞仪检测MDSCs的比例。4.乳腺癌荷瘤鼠建模成功后,随机分为两组,一组给予EP治疗,另一组给予PBS治疗,3天一次,分别于25d和40d处死荷瘤鼠,流式细胞仪检测脾脏、肿瘤中MDSCs的比例。5.从健康的BALB/c小鼠股骨中取出骨髓,用MDSCs免疫磁珠体外分选出G-MDSCs和M-MDSCs,体外用重组HMGB1刺激48h后,流式细胞仪检测各组细胞中MDSCs、DCs和巨噬细胞的比例。结果:1.流式细胞仪检测结果显示荷瘤鼠外周血、脾脏中MDSCs的比例显著高于正常鼠,q RT-PCR检测发现肿瘤组织中HMGB1、i NOS和ARG1的表达量都显著高于癌旁组织,差异有统计学意义。2.经过48h刺激后,流式细胞仪检测结果发现HMGB1组、GM-CSF+IL-6组、GM-CSF+IL-6+HMGB1组相比于对照组,MDSCs比例增加,DCs和巨噬细胞的比例减少,差异有统计学意义;GM-CSF+IL-6+HMGB1+EP组相比于GM-CSF+IL-6+HMGB1组,MDSCs比例减少,DCs和巨噬细胞的比例增加。3.细胞给予250ng/m L HMGB1刺激后,0至120min内,细胞内p-ERK1/2、p-NF-κB、p-P38水平随着时间推移逐渐增高,而p-STAT3却没有这种趋势;给予U0126、SB203580和PDTC作用后,MDSCs比例下降且有统计学意义,而Niclosamide作用后MDSCs比例虽下调但并无统计学意义。4.荷瘤鼠给予EP治疗后,EP组相比于PBS组,肿瘤的体积、重量、脾脏和肿瘤中MDSCs比例均减少且差异有统计学意义。5.MDSCs免疫磁珠体外分选出G-MDSCs和M-MDSCs,体外用HMGB1重组蛋白刺激48h后,流式细胞仪检测发现HMGB1刺激组相对于G-MDSCs和M-MDSCs对照组,MDSCs比例均增加,DCs和巨噬细胞的比例均减少,但无统计学差异。结论:1.在乳腺癌中HMGB1表达上调,MDSCs比例增加,且两者呈正相关关系。2.HMGB1通过NF-κB,ERK1/2和P38 MAPK信号通路调控MDSCs分化,且抑制HMGB1能减少MDSCs的募集,减缓肿瘤生长。
【关键词】：高迁移率族蛋白B1 髓源性抑制细胞 乳腺癌 分化
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9;R730.43
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 缩略词表12-15
• 第一章 绪论15-25
• 1.1 乳腺癌的研究现状15-16
• 1.2 高迁移率族蛋白B116-19
• 1.2.1 高迁移率族蛋白B1的结构16
• 1.2.2 HMGB1的分泌和释放16-17
• 1.2.3 HMGB1的受体及信号转导通路17-18
• 1.2.4 HMGB1的生物学功能18-19
• 1.3 髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)19-23
• 1.3.1 MDSCs的来源及亚群19-20
• 1.3.2 MDSCs的扩增及活化20-21
• 1.3.3 MDSCs的免疫抑制功能及MDSCs与肿瘤21-23
• 1.4 本研究的目的、方法、实验设计和意义23-25
• 1.4.1 研究目的23
• 1.4.2 研究方法23
• 1.4.3 实验设计23-24
• 1.4.4 实验意义24-25
• 第二章 乳腺癌肿瘤微环境中MDSCs的变化及其与HMGB1的关系25-38
• 2.1 实验仪器和试剂25-27
• 2.1.1 实验仪器25-26
• 2.1.2 实验试剂26-27
• 2.2 实验方法27-32
• 2.2.1 流式细胞仪检测外周血、脾脏中MDSCs比例27-28
• 2.2.2 实时荧光定量PCR检测HMGB1、ARG1和iNOS表达28-30
• 2.2.3 溶液的配制30-31
• 2.2.4 免疫印迹法（Western blotting）31-32
• 2.2.5 统计学分析32
• 2.3 实验结果32-36
• 2.3.1 乳腺癌荷瘤鼠模型的建立32-33
• 2.3.2 MDSCs在正常鼠、荷瘤鼠脾脏和外周血中的比例33-35
• 2.3.3 荷瘤鼠癌组织和癌旁组织中ARG1、iNOS和HMGB1的表达35-36
• 2.3.4 乳腺癌肿瘤微环境中HMGB1和MDSCs的相关性分析36
• 2.4 讨论36-38
• 第三章 HMGB1调控MDSCs分化及其分子机制研究38-49
• 3.1 实验仪器和试剂38-39
• 3.1.1 实验仪器38-39
• 3.1.2 实验试剂39
• 3.2 实验方法39-42
• 3.2.1 MDSCs分离与纯化39-41
• 3.2.2 流式细胞仪检测MDSCs、DCs和巨噬细胞的比例41
• 3.2.3 免疫印迹法（Western blotting）41
• 3.2.4 统计学分析41-42
• 3.3 实验结果42-46
• 3.3.1 HMGB1调控骨髓来源MDSCs的分化42-44
• 3.3.2 HMGB1通过ERK1/2、P38MAPK和NF-κB信号通路调控MDSCs的分化44-45
• 3.3.3 HMGB1调控M-MDSCs或G-MDSCs的分化45-46
• 3.4 讨论46-49
• 第四章 抑制HMGB1延缓乳腺癌荷瘤鼠肿瘤的生长49-56
• 4.1 实验仪器和试剂49-50
• 4.1.1 实验仪器49
• 4.1.2 实验试剂49-50
• 4.2 实验方法50-51
• 4.2.1 乳腺癌荷瘤鼠的分组和治疗50-51
• 4.2.2 流式细胞仪检测各组荷瘤鼠脾脏和肿瘤组织中MDSCs的比例51
• 4.2.3 统计学分析51
• 4.3 实验结果51-54
• 4.3.1 EP抑制HMGB1可以延缓肿瘤生长51-52
• 4.3.2 EP治疗后肿瘤的生长曲线分析52-53
• 4.3.3 EP抑制HMGB1减少荷瘤鼠脾脏和肿瘤组织中MDSCs的比例53-54
• 4.4 讨论54-56
• 第五章 乳腺癌肿瘤微环境中HMGB1表达上调及潜在机制研究56-64
• 5.1 实验仪器、试剂和溶液的配制56-57
• 5.1.1 实验仪器56-57
• 5.1.2 实验试剂57
• 5.1.3 溶液的配制57
• 5.2 实验方法57-59
• 5.2.1 皮下移植瘤模型的建立57
• 5.2.2 组织总RNA提取及定量PCR检测miRNA、HMGB157-58
• 5.2.3 免疫印迹法（Western blotting）58-59
• 5.2.4 统计学分析59
• 5.3 实验结果59-61
• 5.3.1 HMGB1在乳腺癌组织及癌旁组织的表达59-60
• 5.3.2 miR-21、miR-155、miR-218、miR-222、miR-494在乳腺癌组织及癌旁组织的表达水平60-61
• 5.3.3 miR-21、miR-155、miR-218、miR-222、miR-494和HMGB1表达的相关性分析61
• 5.4 讨论61-64
• 主要结论与展望64-65
• 参考文献65-76
• 致谢76-77
• 攻读学位期间发表文章情况77

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