溶血磷脂酸对肝癌细胞迁移的影响及其相关机理研究

发布时间：2017-09-18 07:01

  本文关键词：溶血磷脂酸对肝癌细胞迁移的影响及其相关机理研究

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【摘要】：肝癌作为全球范围内最常见的癌症之一,其发病率和死亡率在恶性肿瘤中分别位居第五位和第二位。近年来,肝癌的发病率在全球范围内不断增加,每年大约有70万人死于肝癌。目前肝癌的治疗方式有手术切除、放射治疗和化学药物治疗等,但这些治疗方法仍然不能阻止肝癌的复发和转移,如何更好的预防和治疗肝癌仍然是临床上面临的难题。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一种广泛存在的生物活性磷脂,参与调节细胞的多种生理和病理过程。研究发现癌变组织中LPA的含量远远高于正常组织,并参与了癌症的发生和发展过程。LPA与肿瘤细胞运动能力的变化密切相关,而肿瘤细胞运动能力的改变是癌症恶化和转移的前提条件。因此,探究LPA对肿瘤细胞迁移的影响及其相关机理具有十分重要的意义。已经有研究报道了LPA对多种肿瘤细胞迁移能力的影响,但由于肿瘤细胞种类繁杂,LPA对肿瘤细胞迁移的影响呈现出一定的组织/细胞特异性。目前,LPA对肝癌细胞迁移行为的影响特征及分子机制,人们还缺乏深入认识。为此,本课题主要探讨了LPA对肝癌细胞迁移能力的影响及其相关机理。主要研究内容和结果如下:(1)LPA对肝癌细胞MHCC97H和HepG2迁移行为的影响采用Transwell法分别考察了LPA对高转移肝癌细胞MHCC97H和低转移肝癌细胞HepG2迁移行为的影响。结果发现,LPA能够明显促进MHCC97H细胞的迁移行为,并在一定浓度范围内呈现剂量相关性。LPA对HepG2细胞的迁移行为没有明显的影响。(2)LPA受体(LPAR)在LPA促肝癌细胞迁移中的作用为了探明两种肝癌细胞迁移行为响应LPA出现差异的原因,采用RT-PCR技术分别检测了MHCC97H和HepG2细胞中LPAR1-6的表达情况。结果发现,MHCC97H表达LPAR1、2、5和6,而HepG2表达LPAR2、3、4、5和6。结果提示,两种肝癌细胞迁移行为对LPA响应的差异可能是由于受体表达模式不同。进一步采用LPAR1/3的特异性抑制剂Ki16425处理MHCC97H细胞后发现,LPA促MHCC97H细胞的迁移行为被明显抑制。实验表明,LPA可能与MHCC97H细胞上LPAR1作用介导了细胞的迁移行为。(3)LPA促MHCC97H细胞迁移的相关机理为了考察RhoA/ROCK信号通路在LPA诱导MHCC97H细胞迁移中的可能作用,实验采用ROCK抑制剂Y-27632处理后观察了MHCC97H细胞迁移对LPA响应的变化。结果发现,与对照组比较,ROCK抑制剂处理明显抑制了LPA促进的MHCC97H迁移能力(p0.01)。细胞骨架F-actin在细胞迁移过程中起重要作用。为了明确F-actin是否参与了LPA影响MHCC97H细胞迁移的过程,采用免疫染色和Western Blot检测了LPA作用下F-actin表达变化。结果显示,LPA能够促进MHCC97H细胞F-actin的表达;LPAR1/3抑制剂和ROCK抑制剂能分别抑制LPA促进的F-actin表达;用细胞松弛素B解聚F-actin后,也废除了LPA对MHCC97H细胞迁移的促进作用。结果表明,LPA可能通过RhoA/ROCK-F-actin信号通路实现对MHCC97H细胞迁移的诱导作用。进一步通过原子力显微镜分析了此过程中细胞力学特性的变化,结果发现,LPA处理后MHCC97H的杨氏模量显著下降,表明LPA能够降低MHCC97H细胞硬度,增加细胞的迁移能力。本文的研究表明,LPA可能与MHCC97H细胞上的LPAR1结合,通过RhoA/ROCK-F-actin信号通路上调F-actin的表达,降低细胞的硬度,从而促进MHCC97H细胞的迁移。该研究结果为全面认识LPA对肿瘤细胞迁移的影响及分子机理提供了实验依据,为临床上肿瘤侵袭转移的靶向干预提供了参考。
【关键词】：溶血磷脂酸 肝癌细胞 细胞迁移 分子机理 杨氏模量
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 1 绪论10-13
• 1.1 研究背景10-11
• 1.1.1 肝癌及其危害10
• 1.1.2 溶血磷脂酸的生物学特性10
• 1.1.3 LPA与肝癌细胞运动能力的关系10-11
• 1.1.4 LPA与细胞生物力学特性的关系11
• 1.2 本文关心的问题11-12
• 1.3 本文研究的目的、内容和意义12-13
• 1.3.1 本文研究的目的12
• 1.3.2 本文研究的内容和意义12-13
• 2 LPA对肝癌细胞迁移行为的影响13-22
• 2.1 引言13
• 2.2 实验材料13-15
• 2.2.1 细胞13
• 2.2.2 主要仪器、耗材13-14
• 2.2.3 主要药品、试剂14
• 2.2.4 主要实验试剂的配制14-15
• 2.3 实验方法15-18
• 2.3.1 细胞培养15
• 2.3.2 细胞迁移分析—Transwell法15-16
• 2.3.3 细胞增殖分析—细胞计数法16-17
• 2.3.4 细胞周期分析—流式细胞术17-18
• 2.4 实验结果18-20
• 2.4.1 细胞形态学观察18
• 2.4.2 LPA对肝癌细胞迁移能力的影响18-19
• 2.4.3 LPA对肝癌细胞增殖能力的影响19-20
• 2.5 分析讨论20-21
• 2.6 本章小结21-22
• 3 LPA受体在LPA促肝癌细胞迁移中的作用22-31
• 3.1 引言22-23
• 3.2 实验材料23-24
• 3.2.1 主要仪器、耗材23-24
• 3.2.2 主要药品、试剂24
• 3.2.3 主要试剂的配制24
• 3.3 实验方法24-26
• 3.3.1 肝癌细胞中LPAR的表达分析——RT-PCR法24-26
• 3.3.2 LPAR1抑制后细胞迁移分析—Transwell法26
• 3.4 实验结果26-27
• 3.4.1 肝癌细胞中LPAR1-6 的表达26-27
• 3.4.2 Ki16425处理能够抑制LPA诱导的细胞迁移27
• 3.5 分析讨论27-29
• 3.6 本章小结29-31
• 4 LPA促肝癌细胞迁移中的相关机理研究31-48
• 4.1 引言31-32
• 4.2 实验材料32-34
• 4.2.1 主要仪器、耗材32
• 4.2.2 主要药品、试剂32-33
• 4.2.3 主要试剂的配制33-34
• 4.3 实验方法34-39
• 4.3.1 细胞迁移分析—Transwell法34-35
• 4.3.2 细胞中F-actin的变化分析—免疫荧光染色法35
• 4.3.3 细胞中F-actin的变化分析—Western Blot35-38
• 4.3.4 细胞杨氏模量变化分析—AFM38-39
• 4.4 实验结果39-45
• 4.4.1 Y-27632 处理能够抑制LPA诱导的细胞迁移39-40
• 4.4.2 F-actin参与了LPA诱导的MHCC97H迁移40-44
• 4.4.3 LPA促MHCC97H迁移过程中细胞硬度的变化44-45
• 4.5 分析讨论45-47
• 4.6 本章小结47-48
• 5 结论与展望48-50
• 5.1 主要结论48
• 5.2 后续研究工作的展望48-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-57
• 附录57
• 作者在攻读学位期间发表的论文目录57

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