低氧诱导的ER应激及上皮间质转化在人肝细胞癌中作用的初步研究

发布时间：2017-09-19 19:34

  本文关键词：低氧诱导的ER应激及上皮间质转化在人肝细胞癌中作用的初步研究

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【摘要】：内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞最重要的细胞器之一,它是一种由封闭的膜系统以及相互沟通的膜腔而形成的一种网状结构,它参与了蛋白质的合成与组装,分泌与转位等,可以说在细胞生命活动中扮演着重要的角色。当ER中未折叠或者错误折叠的蛋白质聚集超过了ER负荷时,就会引起其发生一系列的适应性反应,其中最重要的应答反应当属未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。作为ER应激反应最敏感最重要的感应器蛋白-糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein,GRP78),亦被称为免疫球蛋白重链结合蛋白(Binding immunoglobulin protein,Bi P),首先会与ER膜上的三个跨膜传感器蛋白IRE1(Inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease 1)、PERK(PKR-like Endoplasmic Reticulum Kinase)以及ATF6(Activating Transcription Factor 6)解离,当这一解离过程完成后,使得原先被Bi P封闭的信号通路激活。PERK活化后会磷酸化真核起始转录因子e IF2ɑ,导致细胞内整体m RNA的转录翻译水平明显降低,同时又会选择性的增强某些m RNA的转录翻译,其中就包括激活转录因子4(Activating Transcription Factor 4,ATF4)及其下游靶基因CHOP(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein);活化的IRE1同时具备激酶和核酸内切酶的作用,IRE1自身磷酸化后剪切XBP1(X-box-binding protein 1)的m RNA产生剪切型的s XBP1,使其转变为活化形式,活化的IRE1同时募集并5激活应激激酶JNK(Jun N-teminal Kinase);此外与Bi P解离的ATF6则迅速转位到高尔基体,被其内部的蛋白水解酶剪切成为有活性的转录因子。总之UPR通路的激活的最终目的一方面增强了ER折叠蛋白的能力并通过ER降解部分错误折叠蛋白(ER-associated degradation,ERAD),一方面减少蛋白质的合成减轻ER负荷,在细胞面对外界刺激如缺氧、低糖/高糖、钙离子浓度改变、营养缺乏等时促进细胞生存;而当应激条件持续存在则会导致适应性反应失灵,细胞凋亡程序被启动。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞转化为具有间质细胞表型的生物学过程,主要特征表现为上皮细胞粘附分子蛋白如钙黏附蛋白(E-cadherin)表达减少,细胞骨架蛋白转化为波形蛋白(vimentin),最终导致细胞与基底膜的连接作用减弱,细胞本身失去极性,从而获得了较高的侵袭迁移能力,细胞的抗凋亡能力也相应增强,同时产生额外的细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)。ER应激作为细胞一种适应性的反应被认为与许多疾病的发生发展及预后有着密切的关系,如神经退行性变、病毒所致的感染性疾病以及恶性肿瘤等;而也有越来越多的研究证据表明EMT使得上皮细胞来源的恶性肿瘤获得侵袭迁移能力在肿瘤的发展进程中发挥了重要的作用。恶性实体肿瘤中时常存在高代谢以及过度增殖的特点,癌巢中通常存在氧供不足,因此本论文的研究目的主要就是探究由低氧诱导的ER应激以及EMT在人肝细胞癌中的作用,并通过实验得到了如下初步的实验结果:(1)构建了ER应激重要的感应蛋白Bi P质粒并通过western blot以及细胞免疫荧光验证其在不同细胞株中的表达;(2)通过组织化学染色发现肝细胞癌组织中ER及EMT均表达上调;(3)低氧刺激诱导的不同肝细胞癌细胞株中ER以及EMT相关基因上调,并通过半定量PCR以及western blot分别从m RNA水平及蛋白水平得到验证;(4)在癌组织切片中通过免疫荧光双标意外发现Bi P异位表达及与低氧诱导因子(HIF1ɑ)存在共定位的现象;(5)低氧刺激诱导的不同细胞株中观察到低氧刺激促进Bi P异位入核并与HIF1ɑ表达相关;(6)MTT实验观察到低氧刺激的一定时间内可以促进细胞存活,说明低氧刺激诱导影响细胞的存活。上述的实验结果表明在肝细胞癌中存在ER及EMT,低氧刺激可诱导肝癌细胞ER应激及Bi P异位,该结果提示ER应激以及EMT在人肝细胞癌中发挥了重要的作用。
【关键词】：ER应激 上皮间质转化 肝细胞癌 低氧诱导因子 糖调节蛋白78
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 英文缩略词表（Abbreviation）7-10
• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 1. 前言16-18
• 2. 实验材料18-22
• 2.1 细胞株、菌株18
• 2.2 质粒18-19
• 2.3 抗体19
• 2.4 主要实验试剂19
• 2.5 PCR引物的设计及合成19-20
• 2.6 仪器设备20-22
• 3. 实验方法22-41
• 3.1 实验主要试剂的配制方法22-25
• 3.2 质粒小抽25-26
• 3.3 质粒大抽26-28
• 3.4 石蜡切片免疫组织化学28-29
• 3.5 石蜡切片免疫荧光29-30
• 3.6 细胞免疫荧光30-31
• 3.7 蛋白质免疫印迹（Immune Blot,IB）31-33
• 3.7.1 蛋白样品的制备31
• 3.7.2 SDS-PAGE的胶的预制31-32
• 3.7.3 蛋白上样及电泳32
• 3.7.4 转膜32-33
• 3.7.5 孵育抗体及IB检测33
• 3.8 质粒的构建33-39
• 3.8.1 引物的设计33-34
• 3.8.2 细胞RNA的提取34-35
• 3.8.3 扩增目的片段35-36
• 3.8.4 凝胶电泳及胶回收36-37
• 3.8.5 目的片段的酶切及连接37-38
• 3.8.6 转化及摇菌38
• 3.8.7 质粒酶切鉴定38-39
• 3.9 细胞核浆蛋白分离39-40
• 3.10细胞培养以及转染40
• 3.11实验数据统计学分析40-41
• 4. 实验结果41-63
• 4.1 肝细胞癌组织中ER应激感应蛋白BiP/GRP78异位表达41-42
• 4.2 低氧刺激诱导肝癌细胞株中BiP/GRP78的异位表达42-46
• 4.3 BiP/GRP78与低氧诱导因子HIF1ɑ在细胞核中共定位表达46-48
• 4.4 BiP/GRP78真核表达质粒的构建及验证48-51
• 4.5 肝癌细胞株中低氧诱导ER应激相关蛋白上调表达51-55
• 4.6 低氧对细胞存活的影响55-56
• 4.7 上皮间质转化相关蛋白在肝癌组织中的表达56-60
• 4.8 低氧刺激诱导ER应激及EMT相关基因mRNA的表达60-63
• 5. 讨论63-66
• 5.1 ER应激感应蛋白BiP/GRP78异位表达63-64
• 5.2 肝癌细胞株中低氧刺激诱导ER应激64-65
• 5.3 低氧刺激诱导改变肝癌细胞株EMT相关蛋白表达水平65-66
• 6. 结论66
• 7. 参考文献66-71
• 附录71-74
• 致谢74-76
• 综述76-88
• 参考文献82-88

【共引文献】

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本文编号：883522