抑制EZH2基因表达对T细胞淋巴瘤放射敏感性的影响

发布时间：2017-09-19 20:04

  本文关键词：抑制EZH2基因表达对T细胞淋巴瘤放射敏感性的影响

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【摘要】：目的:本研究旨在探索抑制EZH2基因表达联合放射对T细胞非霍奇金淋巴瘤(T cell Non-Hodgkin lymphoma,T-NHL)的体外抗肿瘤作用,并阐述EZH2表达降低对放射诱导T-NHL细胞系Hut78与Jurkat增殖及凋亡的影响,为T-NHL的基因联合放射治疗提供新的思路和理论依据。方法:1.采用含EZH2基因序列的sh RNA慢病毒干扰载体及阴性对照(空白载体)分别感染人T细胞淋巴瘤Hut78与Jurkat细胞株。2.通过RT-q PCR和Western-blot方法测定Hut78组(Hut78、Hut78 control、Hut78 EZH2-sh RNA)及Jurkat组(Jurkat、Jurkat control、Jurkat EZH2-sh RNA)细胞中EZH2的表达情况。3.通过MTS/PMS法测定RNA干扰沉默EZH2基因对T-NHL细胞系Hut78及Jurkat增殖能力及放射敏感性的影响。4.采用EZH2小分子抑制剂UNC1999单药处理T-NHL细胞系Hut78及Jurkat,以RT-q PCR和Western-blot方法检测药物处理前后细胞中EZH2的表达情况。5.通过MTS/PMS法测定EZH2小分子抑制剂UNC1999单药及联合X线照射对Hut78及Jurkat细胞增殖及存活率的影响。6.利用流式细胞术检测EZH2小分子抑制剂UNC1999单药及联合X线照射对Hut78和Jurkat细胞凋亡的影响。7.通过罗丹明123(Rhodamine123)染色检测UNC1999联合X线照射对Hut78和Jurkat细胞线粒体膜电位的影响。8.通过Western blot检测EZH2小分子抑制剂UNC1999单药及联合X线照射对Hut78和Jurkat细胞PARP剪切、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:1.采用含EZH2基因序列的sh RNA慢病毒干扰载体及阴性对照感染Hut78与Jurkat细胞,以RT-q PCR检测Hut78组(Hut78、Hut78 control、Hut78EZH2-sh RNA)及Jurkat组(Jurkat、Jurkat control、Jurkat EZH2-sh RNA)三种细胞EZH2在m RNA水平的表达情况。结果显示Hut78 EZH2-sh RNA及JurkatEZH2-sh RNA细胞中EZH2的表达水平分别为31.6%和46.7%,与各组空白对照细胞相比,表达水平明显降低,且具有统计学意义(P0.05);Western-blot检测Hut78组(Hut78、Hut78 control、Hut78 EZH2-sh RNA)及Jurkat组(Jurkat、Jurkat control、Jurkat EZH2-sh RNA)细胞EZH2蛋白的表达水平,提示转染EZH2-sh RNA后细胞EZH2表达明显降低。2.MTS/PMS法检测Hut78组(Hut78、Hut78 control、Hut78 EZH2-sh RNA)及Jurkat组(Jurkat、Jurkat control、Jurkat EZH2-sh RNA)三种细胞的增殖情况,结果发现Hut78组三种细胞的吸光度值分别为0.722±0.016,0.656±0.015和0.209±0.014;Jurkat组三种细胞的吸光度值分别为0.860±0.037,0.794±0.029和0.419±0.045;与其他两组细胞相比,转染EZH2-sh RNA的细胞增殖明显受抑;联合X线照射后,EZH2-sh RNA组细胞存活率显著降低(P0.05),提示EZH2-sh RNA可增强放射对细胞的增殖抑制作用。3.EZH2小分子抑制剂UNC1999处理Hut78及Jurkat细胞,测算IC50值,分别为:28.59和20.28μmol/L;经RT-q PCR和Western-blot方法验证,细胞EZH2表达水平降低。与放射联合应用,对细胞的增殖抑制作用增强,放射敏感性增加。4.流式细胞术测定细胞凋亡:EZH2小分子抑制剂UNC1999处理Hut78和Jurkat细胞,可促进放射诱导的细胞凋亡。5.罗丹明123染色检测细胞线粒体膜电位:EZH2小分子抑制剂UNC1999处理Hut78和Jurkat细胞,导致放射诱导的细胞线粒体膜电位降低更加明显。6.Western blot实验显示:EZH2小分子抑制剂UNC1999处理Hut78和Jurkat细胞,促进放射诱导的PARP剪切,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。结论:采用RNA干扰或小分子抑制剂降低Hut78和Jurkat细胞中EZH2的表达,联合X线照射,可增强放射对细胞的增殖抑制作用,促进放射诱导的细胞凋亡。
【关键词】：EZH2 短发卡RNA 小分子抑制剂 T细胞淋巴瘤 放射
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 对象和方法15-30
• 1.1 材料、试剂与仪器15-18
• 1.1.1 细胞系15
• 1.1.2 质粒15
• 1.1.3 主要实验试剂15-16
• 1.1.4 实验仪器16-17
• 1.1.5 主要试剂配制17-18
• 1.2 实验方法18-30
• 1.2.1 细胞培养18-19
• 1.2.2 重组质粒的转染19-20
• 1.2.3 慢病毒感染Hut78和Jurkat细胞的效果验证20-27
• 1.2.4 MTS/PMS法检测细胞增殖27-28
• 1.2.5 细胞凋亡检测28-29
• 1.2.6 罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位29
• 1.2.7 Western-blot测定凋亡相关蛋白29
• 1.2.8 统计学分析29-30
• 结果30-41
• 2.1 慢病毒介导EZH2-shRNA感染T细胞淋巴瘤Hut78及Jurkat细胞株30-31
• 2.2 RT-q PCR 和 Western-blot 验证转染后细胞中 EZH2 的表达31-32
• 2.2.1 转染后Hut78及Jurkat细胞中EZH2 mRNA的表达水平31
• 2.2.2 转染后Hut78及Jurkat细胞中EZH2蛋白的表达水平31-32
• 2.3 MTS/PMS法检测细胞的增殖活性32-34
• 2.3.1 EZH2-shRNA对Hut78和Jurkat细胞增殖的影响32
• 2.3.2 EZH2-shRNA联合放射对Hut78和Jurkat细胞增殖的影响32-33
• 2.3.3 EZH2-shRNA联合放射对Hut78和Jurkat细胞存活率的影响33-34
• 2.4 EZH2小分子抑制剂（UNC1999）处理Hut78和Jurkat细胞34
• 2.5 RT-qPCR和Western-blot检测UNC1999处理细胞后EZH2表达水平34-35
• 2.5.1 UNC1999处理Hut78及Jurkat细胞后EZH2 mRNA的表达水平34-35
• 2.5.2 UNC1999处理Hut78与Jurkat细胞后EZH2蛋白的表达水平35
• 2.6 UNC1999对Hut78与Jurkat细胞凋亡的影响35-36
• 2.7 UNC1999联合放射对Hut78和Jurkat细胞增殖的影响36
• 2.8 UNC1999联合放射对Hut78和Jurkat细胞凋亡的影响36-38
• 2.9 UNC1999联合放射对Hut78和Jurkat细胞线粒体膜电位的影响38-39
• 2.10 UNC1999联合放射对Hut78及Jurkat细胞凋亡蛋白表达的影响39-41
• 讨论41-46
• 结论46-47
• 参考文献47-50
• 发表论文和参加科研情况说明50-51
• 综述 组蛋白甲基转移酶EZH2在肿瘤发生发展及治疗中的研究进展51-64
• 综述参考文献59-64
• 致谢64

【参考文献】

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1 王海茹;RNA干扰沉默STAT3基因对人喉鳞状细胞癌放射敏感性的影响[D];吉林大学;2009年

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本文编号：883633