HCMV感染上调人星形胶质细胞IGF2分泌对胶质瘤细胞生物学行为影响的分子机制

发布时间：2017-09-21 15:44

  本文关键词：HCMV感染上调人星形胶质细胞IGF2分泌对胶质瘤细胞生物学行为影响的分子机制

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【摘要】：人巨细胞病毒(HCMV)感染和恶性脑胶质瘤关系密切。在胶质瘤微环境中,HCMV的潜伏感染会潜移默化地影响胶质瘤细胞的发展。这种影响途径主要包括:HCMV感染下的星形胶质细胞上调IGF2表达,进而IGF2蛋白的分泌表达量增加,IGF2分泌蛋白通过与普遍表达在胶质瘤细胞表面的IGFI-R结合,介导胶质瘤细胞内MAPK-ATF5通路的活化,最终影响脑胶质瘤细胞生物学行为,促进胶质瘤细胞增殖、分化,且抑制其凋亡。首先利用q RT-PCR技术检测感染HCMV前后星形胶质细胞内IGF2表达量的改变;进而ELISA测定感染前后星形胶质细胞IGF2蛋白分泌量的变化;利用免疫荧光技术观测,与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞,其胞膜表面磷酸化的IGF-IR表达增多。然后在分子水平上探讨HCMV感染通过IGF-IR介导的MAPK-ATF5信号通路,影响胶质瘤细胞内部代谢及重要分子物质的改变。在细胞水平上研究感染对胶质瘤细胞增殖和分化的影响。研究试图阐明在体内潜伏感染的HCMV病毒参与脑胶质瘤增殖与分化的分子机制,为治疗HCMV持续性感染的相关疾病提供新药物靶位和防控新思路。目的:1.检测感染HCMV前后星形胶质细胞IGF2基因的表达和蛋白分泌的改变,研究胶质瘤微环境中HCMV潜伏感染状态下,星形胶质细胞分泌影响脑肿瘤发育的相关细胞因子水平变化。2.建立星形胶质细胞和胶质瘤细胞的共培养模型,模拟体内胶质瘤微环境,对比及研究与HCMV感染的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞和与未被HCMV感染的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞,其胞膜表面分子受体,内部细胞信号通路激活和胶质瘤细胞生物学行为的改变。方法:1.测定模拟HCMV潜伏感染状态所需要的最适MOI值,用最适MOI的HCMV感染人星形胶质细胞,q RT-PCR检测随着时间的延长,星形胶质细胞内IGF2基因表达量的改变。ELISA检测感染后星形胶质细胞分泌IGF2的改变。2.建立体外星形胶质细胞和胶质瘤细胞共培养模型,利用transwell共培养小室模拟体内胶质瘤微环境,上室接种胶质瘤细胞,下室接种星形胶质细胞。3.共培养体系建立后,HCMV感染星形胶质细胞,利用免疫荧光技术激光共聚焦显微镜观测与未感染的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞,与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞,它们的表面受体IGF-IR磷酸化水平的改变。利用q RT-PCR,Western blot测定其胞内MAPK-ATF5信号通路的激活状态。同时利用CCK8检测各组胶质瘤细胞增殖,流式细胞术检测其凋亡率结果:1.实验测得当HCMV的m.o.i.=2时即可以很好地维持星形胶质细胞的生长状态良好,基本不发生形变,又能持续性的分泌IGF2,为下一步研究对胶质瘤细胞影响的研究奠定基础。2.HCMV感染的星形胶质细胞IGF2基因表达量随着时间的延长呈递增趋势。星形胶质细胞外分泌IGF2蛋白的表达量也同步增长。3.建立共培养体系以后,免疫荧光结果显示,与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养胶质瘤细胞表面磷酸化的IGF-IR比例显著增加。并且随着共培养时间的延长,磷酸化IGF-IR的比例有逐步递增的趋势。与未感染了HCMV的星形胶质细胞共培养胶质瘤细胞表面磷酸化IGF-IR比例基本不变,非磷酸化的IGF-IR处于优势地位。4.q RT-PCR以及Western blot验证了IGF-IR下游MAPK-ATF5信号通路的激活,最终将影响到胶质瘤细胞的发展。5.CCK-8检测结果显示:胶质瘤细胞与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养或者培养液中加入外源性IGF2,可以促进其增殖,且后者作用大于前者。而与未感染HCMV的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞增殖明显落后于以上两组。流式细胞术检测结果显示:与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养或者培养液中加入外源性IGF2的胶质瘤细胞凋亡率也呈现降低的趋势,而与未感染HCMV的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞凋亡率基本保持不变。结论:1.HCMV AD169感染人星形胶质细胞将上调IGF2的基因表达,同时也促进了人星形胶质细胞外分泌IGF2蛋白增多。2.与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养的胶质瘤细胞,IGF-IR受体被激活,IGF-IR磷酸化水平升高。在胶质瘤细胞内激活MAPK通路,最终导致了ATF5的高表达。3.MAPK-ATF5通路的激活将会影响胶质瘤细胞的生存及生长,提高胶质瘤细胞的增殖能力,减少了胶质瘤细胞凋亡,加速了病情的恶化甚至死亡。
【关键词】：HCMV感染 IGF2 星形胶质细胞 胶质瘤 ATF5
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 引言9-12
• 第一章 材料12-18
• 1.1 主要仪器设备12
• 1.2 主要实验试剂及配制12-16
• 1.3 组织标本、细胞来源16-18
• 第二章 方法18-35
• 2.1 复苏人星形胶质细胞18
• 2.2 免疫荧光法检测人星形胶质细胞的纯度18
• 2.3 HCMV AD169株毒种的制备和定量18-20
• 2.4 U-87MG星形胶质瘤细胞传代培养的建立20-21
• 2.5 qRT-PCR检测HCMV感染前后星形胶质细胞内IGF2和IE2基因表达水平的变化21-24
• 2.6 ELISA测定感染HCMV前后星形胶质细胞分泌IGF2的变化24-26
• 2.7 建立星形胶质细胞和胶质瘤细胞的共培养体系的建立26-27
• 2.8 共培养体系中U87胶质瘤细胞的IGF-IR,KRAS,BRAF,CREB3L2 and ATF5mRNA表达情况27-30
• 2.9 Western Blot检测共培养体系中U87细胞Phospho-IGF-IR,Phospho-ERK1/2，IGF-IR ，ERK1/2 和ATF5蛋白的表达情况30-32
• 2.10 CCK-8 比色法检测共培养对U87细胞增殖的影响32
• 2.11 Annexin V/ 7-AAD染色及流式细胞仪检测共培养后的U87细胞凋亡32-33
• 2.12 免疫荧光检测共培养前后U87细胞表面IGF-IR和Phospho-IGF-IR表达的改变33-34
• 2.13 统计学分析34-35
• 第三章 结果35-43
• 3.1 体外培养的星形胶质细胞表达的GFAP35
• 3.2 HCMV AD169毒株的定量35
• 3.3 选择HCMV AD169毒株感染星形胶质细胞的最适MOI值35-36
• 3.4 HCMV AD169毒株感染星形胶质细胞后IGF2基因表达上调，，分泌IGF2蛋白增多。36-37
• 3.5 HCMV AD169感染星形胶质细胞后使其分泌IGF2蛋白增多37-38
• 3.6 感染HCMV的星形胶质细胞和U87胶质瘤细胞共培养引起U87细胞表面受体表达的改变，IGF-IR表达下调，而Phospho-IGF-IR表达上调38
• 3.7 与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养的U87胶质瘤细胞内ERK/MAPK通路及ATF5的激活38-41
• 3.8 与感染了HCMV的星形胶质细胞共培养的U87细胞增殖活力提高41
• 3.9 流式细胞术检测各组U87胶质瘤细胞凋亡41-43
• 第四章 讨论43-46
• 4.1 HCMV感染及胶质瘤细胞中ATF5表达对胶质瘤发生发展起到了至关重要的意义43-44
• 4.2 IGF2和IGF-ⅠR的作用功能及其与神经系统的关联44
• 4.3 星形胶质细胞在胶质瘤微环境中的重要地位44-46
• 第五章 结论46-47
• 参考文献47-49
• 文献综述49-63
• 参考文献61-63
• 攻读学位期间的研究成果63-64
• 致谢64-65

【参考文献】

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1 张慈安;魏品康;李勇进;;肿瘤酸性微环境的研究进展[J];肿瘤;2010年06期

本文编号：895436