血清饥饿对U251细胞氧化磷酸化活性的影响及其分子机制研究

发布时间：2017-10-02 23:39

  本文关键词：血清饥饿对U251细胞氧化磷酸化活性的影响及其分子机制研究

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【摘要】：氧化磷酸化是细胞维持正常生命活动的主要供能方式,早期的研究发现在肿瘤组织中,肿瘤细胞以糖酵解为主为细胞增殖提供能量,这一效应被称为“瓦伯格效应”。近年来的研究显示,不同的肿瘤细胞其能量代谢方式存在一定的差异,同时在不同的培养条件和微环境中,肿瘤细胞会改变其原有的代谢途径,以适应细胞的生长。因此开展肿瘤代谢途径及分子调节机制的研究对深入了解和认识肿瘤的生长、增殖机制及肿瘤的临床治疗都有重要的意义。 血清是细胞生长必需的成分,细胞在无血清或低血清培养基中培养一段时间后,细胞将停滞在G0/G1期,细胞生长明显受抑制。因此血清饥饿培养是体外细胞培养的一个逆环境,研究逆境条件下即血清饥饿培养条件下,肿瘤细胞的能量代谢途径、氧化磷酸化活性及代谢相关的基因的表达变化,将有助于对肿瘤代谢调节机制的研究。本研究以293T细胞和U251细胞为研究材料,通过不同的呼吸抑制剂处理两种细胞,确定其主要的能量代谢途径。然后研究以糖酵解为主的肿瘤细胞血清饥饿处理对其能量代谢途径、氧化磷酸化活性及其代谢调控相关的基因的表达变化。 本研究用不同浓度的氧化磷酸化电子传递链抑制剂和乳酸脱氢酶抑制剂处理293T细胞和U251细胞后,检测细胞的生长和ATP水平。通过比对两种细胞对抑制剂的敏感性确定其能量代谢类型。研究发现293T细胞对寡霉素处理敏感,寡霉素(Oligo)对293T细胞增殖有显著的抑制作用,说明293T细胞是以氧化磷酸化为主产生ATP。而糖酵解抑制剂草氨酸(Oa)对U251细胞增殖有显著的抑制作用,表明U251细胞以糖酵解为主为细胞提供能量。随后,对以糖酵解为主的U251细胞进行血清饥饿处理不同时间,分析血清饥饿对U251细胞增殖、ATP水平、呼吸代谢途径及氧化磷酸化活性的影响。研究发现血清饥饿处理后,U251细胞生长明显受抑制,细胞被阻滞在G0/G1期；细胞ATP水平显著上升,细胞ROS水平降低。对代谢相关的酶活性和表达水平检测发现乳酸脱氢酶(LDH)蛋白表达及活性下降,丙酮酸脱氢酶(PDH)蛋白表达及活性升高；细胞线粒体数量增加,线粒体DNA拷贝数增加,线粒体电子传递复合物I活性增强；细胞氧化磷酸化相关蛋白(NDUFB8、NDUFA9、VDAC、ND1)含量升高；以上结果显示血清饥饿后U251细胞糖酵解途径受抑制,氧化磷酸化活性增强。同时我们又检测了细胞代谢调控相关蛋白的表达水平的变化,结果发现血清饥饿后U251细胞HIF-1α蛋白表达水平显著降低,C-myc、NRF1、TFAM蛋白含量均有明显增加；同时检测到细胞周期调控蛋白p27表达升高、CyclinD1蛋白含量增加、CyclinB1蛋白含量降低。 综上所述,以糖酵解为主的U251细胞经血清饥饿处理后,细胞生长明显受抑制,细胞被阻滞在G0/G1期,ATP水平增加,ROS水平降低,细胞糖酵解途径受抑制,氧化磷酸化活性增强。调控其代谢途径改变的可能的分子机制是血清饥饿处理使HIF-1α下调,抑制糖酵解途径,同时促进C-myc蛋白水平上调。C-myc通过促进NRF1的表达,促进线粒体转录调控因子TFAM上调,进而增强线粒体DAN复制,转录及翻译水平,促进细胞氧化磷酸化活性增强,细胞ATP含量升高。U251细胞在饥饿条件下ATP水平的增加可能是逆境环境中细胞维持生存的一种应急调节机制。本研究以U251细胞研究对象,通过血清饥饿处理,研究其能量代谢途径的改变及其可能的调节机制,提示肿瘤细胞的能量代谢途径可随着其培养条件及微环境的改变而改变,以适应新的环境。同时对其分子调节机制的研究将对深入了解和认识胶质瘤细胞的生长、增殖机制及脑肿瘤的临床治疗具有重要意义。
【关键词】：血清饥饿 U251细胞 Warburg效应 氧化磷酸化
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-7
• 缩略词对照表7-11
• 第1章 引言11-24
• 1 细胞能量代谢11-14
• 1.1 无氧呼吸11-13
• 1.2 有氧呼吸13-14
• 2 线粒体结构与氧化磷酸化14-20
• 2.1 线粒体结构14-15
• 2.2 线粒体功能15
• 2.3 氧化磷酸化活性15-20
• 2.3.1 线粒体数量15-16
• 2.3.2 线粒体DNA拷贝数16
• 2.3.3 线粒体蛋白16-17
• 2.3.4 线粒体呼吸链的组成17-20
• 3 肿瘤细胞能量代谢20-23
• 3.1 WARBURG效应21-22
• 3.2 CRABTREE效应22-23
• 4 研究的目的和意义23-24
• 第2章 材料与方法24-41
• 2.1 实验材料24-27
• 2.1.1 细胞株24
• 2.1.2 培养基、血清及胰酶24
• 2.1.3 PCR引物合成24
• 2.1.4 主要试剂及耗材24-26
• 2.1.5 主要仪器26-27
• 2.2 实验方法27-41
• 2.2.1 细胞培养27-28
• 2.2.2 呼吸抑制剂处理细胞检测细胞生长(MTS)及细胞ATP含量变化28-29
• 2.2.2.1 呼吸抑制剂处理28-29
• 2.2.2.2 呼吸抑制剂处理细胞检测细胞生长(MTS)29
• 2.2.2.3 呼吸抑制剂处理细胞检测ATP含量29
• 2.2.3 细胞ATP检测29-30
• 2.2.4 血清饥饿30
• 2.2.5 细胞周期流式检测30
• 2.2.6 细胞计数30-31
• 2.2.7 细胞ROS流式检测31
• 2.2.8 PDH活性检测31-32
• 2.2.9 LDH活性检测32-33
• 2.2.10 DNA提取33
• 2.2.11 RT-PCR33-35
• 2.2.12 MIT GREEN流式检测35
• 2.2.13 免疫荧光35
• 2.2.14 WESTERN BLOT35-39
• 2.2.15 线粒体复合物I活性检测39-41
• 第3章 实验结果41-56
• 3.1 293T、U251细胞能量代谢途径检测41-45
• 3.2 血清饥饿对U251细胞生长和ATP含量的影响45-48
• 3.2.1 血清饥饿对U251细胞生长的影响45-47
• 3.2.2 血清饥饿对U251细胞ATP及ROS含量的影响47-48
• 3.3 血清饥饿对U251细胞PDH、LDH蛋白表达及活性的影响48-50
• 3.4 血清饥饿对U251细胞氧化磷酸化活性的影响50-55
• 3.4.1 血清饥饿对U251细胞线粒体数目的影响50-51
• 3.4.2 血清饥饿对U251细胞线粒体MTDNA的影响51-52
• 3.4.3 血清饥饿对U251细胞线粒体呼吸链复合物I活性的影响52-53
• 3.4.4 血清饥饿对U251细胞OXPHOS相关蛋白表达的影响53-54
• 3.4.5 血清饥饿对U251细胞OXPHOS活性调控蛋白表达的影响54-55
• 3.5 血清饥饿对U251细胞细胞周期相关蛋白的影响55-56
• 第4章 讨论56-58
• 4.1 肿瘤代谢途径的多样性56
• 4.2 培养条件和微环境影响肿瘤代谢途径56
• 4.3 血清饥饿U251细胞通过降低HIF-1α升高增加细胞ATP含量56-58
• 结论58-60
• 参考文献60-63
• 附录1：常见溶液的配制方法63-65
• 附录2：硕士研究生期间论文发表和项目参与情况65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘岷,邝胜利;缺氧诱导因子活性的调节[J];河南医学研究;2004年01期

2 罗兰,何云刚,舒坤贤,赖建华,谭德勇,张虹;血清对人脑胶质瘤细胞株U251基因表达的影响[J];云南大学学报(自然科学版);2000年02期

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本文编号：961830