MiRNA-451调控人脑胶质瘤细胞葡萄糖能量代谢和生物学行为的机制研究

发布时间：2017-10-03 01:18

  本文关键词：MiRNA-451调控人脑胶质瘤细胞葡萄糖能量代谢和生物学行为的机制研究

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【摘要】：恶性胶质瘤是人类中枢神经系统中最常见的原发性颅脑肿瘤,中位生存期约14个月,其具有易复发,无限增殖和侵袭性生长的特点,给临床治疗增加很大难度,传统神经外科手术和放化疗方法仍然难以完全治愈恶性胶质瘤。恶性胶质瘤是一种多基因异常表达的肿瘤,包括原癌基因的异常过表达和抑癌基因的缺失或突变,导致肿瘤细胞逃避了正常生长机制的调控。随着近几年基因和分子生物学的快速发展,探索胶质瘤的发生和发展的分子机制和寻找新的治疗手段成为国内外领域研究重点方向。miRNA是一类长度大约为19-25个核苷酸序列的非编码RNAs,能够与靶基因的3’端非转录区域部分或者全部特异性结合,从而降解靶mRNA或者抑制其蛋白质的翻译过程,从而实现对基因转录后进行调控。到目前为止,在人类组织和细胞中发现了上千种miRNAs,并且约三分之一的蛋白质编码基因通过miRNA调控,具有高度的时空和组织特异性。同一miRNA可以同时靶向调控多个mRNA基因,并且一个靶向mRNA基因也可以同时被多个不同的miRNA分子调控,故miRNA的作用方式被称之为“一对多或者多对一”。与靶基因相互作用,它们不仅参与了细胞和组织生长发育,新陈代谢,新生血管形成,而且介导细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学过程,在肿瘤的发生、发展过程中的能量代谢方面起着重要的调控作用。因此,它将为肿瘤研究领域包括肿瘤标志物和肿瘤的靶向治疗等方面提供新的研究方向。大量研究证明miRNA-451位于染色体17q11.2位置,与HER2的17q11.2-21区域相毗邻,在很多恶性肿瘤中异常表达,尤其在恶性胶质瘤干细胞中表达量显著降低。Godlewski等研究认为miRNA-451能抑制胶质瘤细胞的迁移,并通过RT-PCR方法证明了发生迁移的胶质瘤细胞中的miRNA-451表达出现了降低。Godlewski等还提出了miRNA-451在某种条件下能够控制能量代谢的开关,使肿瘤细胞在恶劣的代谢环境压下仍能够发生适应性的改变。Kim Y等研究证明在恶性胶质瘤细胞的增殖和侵袭过程中miRNA-451与AMPK之间存在相互拮抗的作用,miRNA-451的过表达或者CAB39/AMPK信号通路受到阻断都能明显抑制恶性胶质瘤细胞的侵袭能力。David Carling等认为AMPK是一种天然的能量感受器,介导真核生物的能量平衡。Christine K等认为抑制PI3K/AKT通路能够阻止肿瘤细胞糖酵解代谢葡萄糖提供能量。Warburg等认为肿瘤细胞不管在有氧还是无氧条件下都通过糖酵解反应消耗葡萄糖提供能量(ATP)。而葡萄糖进入肿瘤细胞内进行能量代谢须依赖于细胞膜上的蛋白载体(葡萄糖转运蛋白,GLUT)进行转运。且GLUT1是哺乳动物中表达最为广泛的转运体,尤其在脑实质细胞中更为常见。而GLUT1作为GLUTs家族中的典型代表,在很多肿瘤中明显高表达,尤其在恶性胶质瘤当中表达量明显增高。本课题组前期研究已经阐述了miRNA-451能够抑制了恶性胶质瘤细胞的生长,但是具体的作用机制尚不清楚。因此本次研究目的是探索miRNA-451基因对恶性胶质瘤细胞葡萄糖转运的调控作用,进而影响其葡萄糖能量代谢效率,最终对恶性胶质瘤细胞的生物学行为产生影响。本课题将从以下两个方面进行研究:第一方面:miRNA-451对人脑恶性胶质瘤细胞系的葡萄糖能量代谢影响机制的研究。常规培养人脑胶质瘤细胞系LN229和U87两种细胞系,并用慢病毒载体携带寡核苷酸miRNA-451和miRNA-NC进行转染。实验分为空白对照组(Blank control)、慢病毒miRNA阴性对照组(Lentivirus miRNA negative control,LV-miRNA-NC)和Lentivirus miRNA-451组(简称LV-miRNA-451);实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)实验证明恶性胶质瘤细胞系各组细胞中的miRNA-451转染后的表达水平,并验证各组细胞中的GLUT1 mRNA的表达水平;细胞免疫荧光和Western Blot实验验证GLUT1蛋白在各组细胞中的表达水平;STRING计算机软件以及前期研究成果构建miRNA-451调控GLUT1基因的信号通路;Western Blot实验进一步验证miRNA-451调控GLUT1基因信号通路中相关目的蛋白的表达量;多功能酶标仪分析各组细胞的葡萄糖摄取量、乳酸产生量以及ATP产生量。结果显示:与Blank control组和LV-miRNA-NC组相比,RT-PCR研究结果表明LV-miRNA-451组的miRNA-451基因表达量明显上调,并且GLUT1 mRNA的表达水平明显降低;细胞免疫荧光和Western Blot实验证明LV-miRNA-451组的GLUT1蛋白表达量明显降低;信号通路图显示miRNA-451靶标CAB39通过LKB1/AMPK和PI3K/Akt两条通路调控GLUT1基因表达;Western blot实验结果证明LV-miRNA-451组miRNA-451调控GLUT1基因信号通路中相关目的蛋白CAB39、LKB1、AMPK、PI3K、Akt以及GLUT1蛋白表达量都显著降低;多功能酶标仪检测结果证明LV-miRNA-451组的细胞内葡萄糖摄取量显著减少,乳酸产生量明显减少以及ATP产物明显减少,差异都具有统计学意义(P0.05)。第二方面:miRNA-451对人脑恶性胶质瘤细胞系生物学行为影响的研究。按照上述方法转染并分组,定量聚合酶链反应(RT-PCR)实验证明恶性胶质瘤细胞系各组细胞中的miRNA-451转染后的表达水平;CCK-8法和细胞平板克隆形成实验检测胶质瘤细胞系各组细胞增殖活性能力;Transwell实验验证胶质瘤细胞系各组细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测胶质瘤细胞系各组细胞迁移能力;Western blot实验检测恶性胶质瘤细胞生物学行为相关目的蛋白表达量。结果显示:与Blank control和LV-miRNA-NC组相比,RT-PCR实验证明LV-miRNA-451组的miRNA-451表达量明显上调;CCK-8法和细胞平板克隆实验表明LV-miRNA-451组的细胞增殖活性能力显著减弱;Transwell实验结果证明LV-miRNA-451组细胞侵袭能力明显减弱;细胞划痕实验结果显示LV-miRNA-451组细胞迁移能力明显受到抑制;Western blot实验结果显示LV-miRNA-451组恶性胶质瘤细胞生物学行为相关的目的蛋白Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、PCNA以及E-Cadherin蛋白表达量明显降低,差异都具有统计学意义(P0.05)。结论:miRNA-451靶向CAB39通过LKB1/AMPK和PI3K/Akt两条通路明显抑制胶质瘤细胞系中的GLUT1基因表达,降低了其葡萄糖转运率降低,从而导致恶性胶质瘤细胞葡萄糖摄取量和能量产生量降低;最终导致miRNA-451明显抑制了恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。
【关键词】：恶性胶质瘤 miRNA-451 GLUT1 葡萄糖代谢 增殖 侵袭 迁移
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语/符号说明13-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、MiRNA-451调控人脑胶质瘤细胞葡萄糖能量代谢的研究17-51
• 1.1 引言17-18
• 1.2 材料和方法18-29
• 1.2.1 材料18-21
• 1.2.2 方法21-29
• 1.3 结果29-47
• 1.3.1 RT-PCR检测miRNA-451以及GLUT1基因的表达水平29-36
• 1.3.2 细胞免疫荧光实验检测GLUT1蛋白表达水平36-38
• 1.3.3 Western blot实验检测GLUT1蛋白表达水平38-40
• 1.3.4 构建并验证miRNA-451调控GLUT1基因的信号通路40-43
• 1.3.5 miRNA-451抑制葡萄糖摄取能力、乳酸产生能力和ATP产生能力43-47
• 1.4 讨论47-50
• 1.5 小结50-51
• 二、MiRNA-451调控人脑胶质瘤细胞生物学行为的研究51-73
• 2.1 引言51
• 2.2 材料和方法51-54
• 2.2.1 材料51-52
• 2.2.2 方法52-54
• 2.3 结果54-68
• 2.3.1 Real-time PCR检测转染后恶性胶质瘤细胞中miRNA-451的表达水平54-55
• 2.3.2 CCK-8 法检测恶性胶质瘤细胞增殖能力55-57
• 2.3.3 平板克隆实验检测恶性胶质瘤细胞克隆形成能力57-59
• 2.3.4 Transwell实验检测恶性胶质瘤细胞侵袭能力59-62
• 2.3.5 细胞划痕实验检测恶性胶质瘤细胞迁移能力62-66
• 2.3.6 Western blot检测恶性胶质瘤细胞生物学行为相关目的蛋白表达66-68
• 2.4 讨论68-72
• 2.5 小结72-73
• 结论73-74
• 参考文献74-82
• 发表论文与参与科研情况说明82-83
• 综述 MiRNAs与GLUT1在肿瘤能量代谢中的研究进展83-94
• 综述参考文献89-94
• 致谢94-96
• 个人简历96

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