靶向Survivin基因miRNA真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞增殖的影响

发布时间：2017-10-05 15:45

  本文关键词：靶向Survivin基因miRNA真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞增殖的影响

  更多相关文章： 真核表达载体 Survivin miRNA 人结肠癌细胞

【摘要】：目的：靶向Survivin基因的微小]RNA(microRNA,miRNA)真核表达载体的构建以及探讨其对人结肠癌(HT-29)细胞增殖、凋亡的影响。方法：(1)设计合成4对针对Survivin基因不同位点的miRNA序列,利用转化技术将目的片段定向克隆至pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR真核表达载体上,构建靶向survivin基因的miRNA重组质粒并进行测序鉴定。(2)HT-29细胞接种于6孔板,空质粒与四组重组质粒瞬时转染进入细胞中,48小时后荧光倒置显微镜观测各组细胞荧光情况,应用流式细胞仪检测细胞转然后的转染效率,选择转染效率最高的组为目的基因组。(3)将目的基因组以及空质粒组菌株复苏,LB培养基培养,利用碱变性法提取得到相应质粒DNA,并对所提取的质粒进行浓度以及纯度的测定。(4)继续接种细胞并将细胞分为空白对照组、转染试剂组、空质粒组(阴性对照组,negtive control,NC)以及目的基因组(阳性对照组,positive control,PC)四组。瞬时转染48小时后收集各组细胞,应用流式细胞仪检测各组细胞的增殖指数(proliferation index,PI)以及凋亡率(apoptosis rate,AR),实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)测定各组Survivin mRNA的表达量,转染72小时后,收集各组细胞利用免疫印迹法(Western blot)检测靶基因：Survivin蛋白的表达情况。结果：(1)对构建的4组pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR真核表达载体载体进行测序,结果显示载体构建成功。(2)HT-29细胞转染后,目的基因组细胞增殖指数与其他各组相比有明显降低(t=20.05, P0.01;t=18.75, P0.01;t=18.59, P0.01),凋亡率明显增高(t=16.40, P0.01;t=15.84, P0.01;t=15.92, P0.01),正常组、空质粒组以及转染试剂组两两比较未见明显差异(P0.05)；靶基因的survivin mRNA表达明显降低(t=0.68, P0.01;t=0.58, P0.01;t=0.61, P0.01),蛋白的表达亦明显降低(t=0.64, P0.01; t=0.62, P0.01;t=0.67, P0.01),正常组、空质粒组以及转染试剂组两两比较亦未见明显差异(P＞0.05)。结论：(1)成功构建靶向Survivin基因的真核表达载体pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR。(2)将质粒转染入HT-29细胞后,可以沉默HT-29细胞Survivin基因的表达,明显促进结肠癌细胞的凋亡,并能够抑制结肠癌细胞的增殖。
【关键词】：真核表达载体 Survivin miRNA 人结肠癌细胞
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 缩略词表8-10
• 前言10-12
• 1 试验材料12-17
• 2 试验方法17-27
• 3 结果27-32
• 4 讨论32-37
• 5 结论37-38
• 参考文献38-42
• 文献综述42-52
• 参考文献48-52
• 致谢52-53
• 研究生期间发表论文和参加科研情况说明53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘紫玲;彭志平;史学森;;胃癌相关miRNA的临床应用价值[J];基础医学与临床;2014年04期

2 魏东;邹浩;王琳;吴雪松;骆志玲;王滔;张小文;;靶向miRNA干扰Bmi-1表达对人胆囊癌细胞增殖效应的影响[J];实用医学杂志;2014年05期

3 徐学虎;吴小兵;伍尚标;江庆萍;刘海波;陈戎;孙嫣;;miR-490-5p和miR-363作为结直肠癌诊断标记的研究[J];中华胃肠外科杂志;2014年01期

4 秦涛;付强;刘传江;胡明星;唐强;王玉柱;薛飞;张莉;张宏伟;;微小RNA-135a对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响[J];中华实验外科杂志;2014年01期

5 孙婷婷;罗善顺;韩辉;;微小RNA与动脉粥样硬化的研究进展[J];中华老年心脑血管病杂志;2013年02期

6 张冬雪;陈璐璐;廖云飞;;微小RNA在2型糖尿病相关机制中的研究进展[J];中华内分泌代谢杂志;2012年11期

7 李三红;刘会春;周少波;;miRNA干扰乙酰肝素酶基因对胆囊癌细胞侵袭、迁移的影响[J];中华实验外科杂志;2011年12期

8 王家祥;韦源;胡倩;刘秋亮;范应中;杨合英;李苏宁;张大;张谦;;人肝癌细胞株与正常肝细胞株MicroRNA差异表达谱研究[J];中华肝胆外科杂志;2011年06期

9 孙凯;曾俊杰;王伟;吴承堂;雷尚通;李国新;;微小RNA-221对结直肠癌中CDKN1C/P57表达调控的研究[J];中华胃肠外科杂志;2011年04期

10 Cameron M Smith;David I Watson;Michael Z Michael;Damian J Hussey;;MicroRNAs, development of Barrett’s esophagus, and progression to esophageal adenocarcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2010年05期

，

本文编号：977650