乳腺癌多药耐药机制与标志物的初步研究

发布时间：2017-10-07 15:29

  本文关键词：乳腺癌多药耐药机制与标志物的初步研究

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【摘要】：背景与目的:乳腺癌是一种严重危害女性健康的常见恶性肿瘤。近几十年来,其发病率逐年上升。每年全世界约有110多万人被诊断为乳腺癌,而有约40多万人死于该病[1]。在欧美国家乳腺癌占女性恶性肿瘤的25%-32%,据美国癌症协会估计,美国每年乳腺癌新发病例有17万,死于乳腺癌的人数为4万[2]。我国虽不属于乳腺癌的高发国家,但我国患者每年平均增长速度却已经高出高发国家2个百分点左右,最糟糕的情况是而且仍然以每年3%的速度递增。在中国国内许多超大城市里,乳腺癌发病率已然上升成为女性恶性肿瘤第一位,成为女性健康的最大威胁。有研究显示,在我国京、津、沪及沿海一些大城市的发病率较高,上海市的发病率居全国首位,而目前天津市乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤发病的第二位,仅仅是排在肺癌之后,而且年龄性别研究发病率显示乳腺癌发病高峰有年轻化的趋势。目前手术、放疗、化疗仍然是乳腺癌的主要治疗手段。辅助化学治疗的使用使早期乳腺癌的生存率提高30%,然而乳腺癌发生耐药是临床上患者治疗失败和死亡的主要原因。肿瘤细胞根据其独有的耐药特点,可将耐药表型分为单药耐药(Primary drug resistance,PDR)和多药耐药(Multidrug resistance,MDR)两大类。而多药耐药和转移的发生是无疑是临床上肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因之一。在过去几十年中,虽然对恶性肿瘤的这两种特性已经有了很广泛的研究,但是大多数只是把其做为两种单独的生物学行为进行研究。近来越来越多的研究表明这两种表型之间的确建立着一种功能上的联系:首先是从亲本细胞中筛选出来的耐药细胞系具有更强的侵袭和转移能力,此外对一些转移性肿瘤的研究发现转移灶细胞比原发瘤的耐药性明显增强,而这与临床上所观察到的发生转移的肿瘤患者化疗效果较差以及化疗效果不好的肿瘤患者容易出现转移的结果相一致。因此,这种肿瘤细胞耐药可以增强其转移能力现象表明,在肿瘤的发生发展过程中,耐药和转移的进展可能不是相互独立的,两种现象之间可能有更直接的联系。最近一些研究表明获得多药耐药的肿瘤细胞通常伴有侵袭能力增强的特性。几种证据显示多药耐药发生时其他信号通路的联合激活会增加多药耐药癌症细胞的侵袭潜能。然而,更精确的机制目前尚不清楚。本研究中,为了更好的理解由耐药性引起的肿瘤形成的相关分子通路,建立了长时间培养在表柔比星药物内的p糖蛋白过表达的人乳腺癌细胞系sk-br-3/epr。sk-br-3/epr表现出来增殖活性的降低,但是同时细胞的侵袭能力增强。同时,可以观察到与肿瘤转移相关的基质金属蛋白酶(mmp-2/9)在sk-br-3/epr细胞中的表达升高。另外,sk-br-3/epr细胞中stat3的活性也提高了。stat3信号通路的激活上调了mmp-2/9的表达,从而进一步增强了sk-br-3/epr细胞的侵袭能力。stat3是众所周知的癌症基因,经常会参与到肿瘤发生形成和对化疗具有抗药性等的过程中。本研究深入探讨了潜在的多药耐药和肿瘤侵袭功能联系的机制。如上所述,乳腺癌的复发转移是造成乳腺癌预后不良的主要原因,1/3乳腺癌患者五年之内会出现复发转移或者病死,如果能尽早发现复发转移灶采取及时的治疗,仍然可以是一部分患者获得较好的疗效,延长患者生存期。乳腺癌的复发转移是一种非常复杂的机制,有很多因素调控,第一部分的研究也部分的讨论了乳腺癌复发转移和多药耐药之间的联系,通过查阅乳腺癌复发转移机制文献,作者发现人附睾蛋白4(he4)是近年来用于卵巢癌早期筛查的肿瘤标志物,有研究证实he4在乳腺癌中也有表达,但是其在乳腺癌中的具体作用和机制研究较少。人附睾蛋白4(he4)是新型的肿瘤标记物,在检测卵巢癌时有很高的灵敏度和特异度。在妇科盆腔肿瘤疾病中诊断中有优势,美国食品药品管理局(fda)已经批准he4用于临床监测卵巢癌的复发与进展,而he4在乳腺癌中的作用还鲜有报道。所以本研究旨在探讨人附睾蛋白4(he4)在乳腺癌发生发展中的机制研究。方法:第一部分:采用细胞培养和引入药物使细胞具有抗性,采用半抑制浓度来测定抗性指数,采用反转录和实时定量pcr检测mrna的表达水平,westernblotting(蛋白印迹法)检测mmp-2/9、stat3、p-stat3、erk1/2、p-erk1/2蛋白表达水平,免疫荧光测定法测定sk-br-3细胞以及无表柔比星培养基中培养的sk-br-3/epr中p糖蛋白表达,利用细胞增殖与克隆形成实验sk-br-3/epr的细胞增殖情况,细胞侵袭实验验证细胞侵袭能力的变化。第二部分:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测15例原发乳腺癌组织及其配对的癌旁正常组织中HE4 mRNA的表达水平。RT-qPCR和Western blot检测常见乳腺(癌)细胞系中HE4 mRNA和蛋白表达水平。通过RNA干扰技术沉默HE4高表达的乳腺癌SK-BR-3细胞中HE4表达,通过CCK-8和克隆形成实验分析沉默HE4表达对SK-BR-3细胞细胞增殖的影响。流式细胞术检测沉默HE4表达对SK-BR-3细胞凋亡的影响。Western blot检测沉默HE4表达对Erk和Akt磷酸化水平的影响。结果:第一部分:升高P-糖蛋白表达量,SK-BR-3/EPR会获得多药耐药表型;SK-BR-3/EPR在随后没有表柔比星的培养基里连续培养六周后还具有多药耐药的表型;SK-BR-3/EPR细胞在细胞增殖率方面有显著减低,而侵袭能力却表现出增强;SK-BR-3/EPR中MMP2/9表达上调;SK-BR-3/EPR细胞中磷酰化和STAT3的激活增加;STAT3的敲减抑制了细胞的侵袭能力同时也下调了SK-BR-3/EPR细胞中MMP2/9的表达。第二部分:HE4 mRNA在乳腺癌组织中高表达;沉默HE4表达抑制乳腺癌细胞SK-BR-3细胞增殖能力,并促进其凋亡,Erk和Akt蛋白磷酸化水平降低。结论:1、成功建立了P糖蛋白过表达的乳腺癌细胞系SK-BR-3/EPR。2、SK-BR-3/EPR细胞表现出侵袭能力增强的特性,同时细胞中MMP-2/9的表达上调。3、STAT3信号介导了MMP-2/9的表达上调,增强SK-BR-3/EPR乳腺癌细胞的侵袭能力。4、SK-BR-3细胞的增殖和凋亡与HE4的表达相关。5、HE4影响Erk和Akt的磷酸化水平。
【关键词】：侵袭 多药耐药 乳腺癌 STAT3 MMP-2 MMP-9 HE4
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-15
• 缩略语15-16
• 前言16-24
• 研究现状、成果16-22
• 研究目的、方法22-24
• 一、乳腺癌多药耐药细胞侵袭能力增强初步研究24-42
• 1.1 对象和方法24-25
• 1.1.1 试剂和药品24
• 1.1.2 主要仪器设备24-25
• 1.2 技术路线25-26
• 1.3 方法26-29
• 1.3.1 细胞培养和抗性引入26-27
• 1.3.2 半抑制浓度实验27
• 1.3.3 反转录和定量PCR27-28
• 1.3.4 Western Blotting28
• 1.3.5 免疫荧光实验28
• 1.3.6 罗丹明 123（Rh123）染料流出实验28
• 1.3.7 细胞增殖实验与克隆形成实验28-29
• 1.3.8 细胞侵袭实验29
• 1.3.9 统计学分析29
• 1.4 结果29-38
• 1.4.1 建立多药耐药（MDR）SK-BR-3/EPR细胞29-30
• 1.4.2 在SK-BR-3/EPR细胞中多药耐药表型的获得依赖于P-糖蛋白的高表达30-31
• 1.4.3 SK-BR-3/EPR细胞在无表柔比星培养基中连续培养6周仍保持有多药耐药的表型31-33
• 1.4.4 SK-BR-3/EPR细胞增殖能力显著降低，，细胞的侵袭能力增强33-34
• 1.4.5 SK-BR-3/EPR细胞中MMP-2/9 的表达上调34-36
• 1.4.6 多药耐药SK-BR-3/EPR细胞中STAT3磷酸化和活化水平提高36
• 1.4.7 SK-BR-3/EPR细胞侵袭能力增强依赖于MMP-2/9 的表达上调36-38
• 1.5 讨论38-40
• 1.6 小结40-42
• 二、乳腺癌肿瘤标记物的初步研究42-55
• 2.1 对象和方法42-43
• 2.1.1 组织标本获得42
• 2.1.2 主要试剂和药品42
• 2.1.3 主要仪器设备42-43
• 2.2 技术路线43
• 2.3 方法43-49
• 2.3.1 细胞培养43-44
• 2.3.2 细胞转染44-45
• 2.3.3 RNA的提取45-46
• 2.3.4 逆转录荧光定量PCR46
• 2.3.5 Western blot46-48
• 2.3.6 CCK-8 实验48
• 2.3.7 克隆形成48
• 2.3.8 流式细胞术48-49
• 2.4 结果49-52
• 2.4.1 HE4在乳腺原位癌组织中的表达水平增高49
• 2.4.2 HE4在乳腺癌细胞中表达水平增高49-50
• 2.4.3 获得HE4降表达的SK-BR-3 细胞50-51
• 2.4.4 HE4促进乳腺癌细胞的增殖51
• 2.4.5 HE4抑制细胞凋亡51-52
• 2.5 讨论52-53
• 2.6 小结53-55
• 结论55-56
• 参考文献56-65
• 发表论文和参加科研情况说明65-66
• 综述 Rack1在蛋白质合成和细胞运动方面作用研究66-79
• 综述参考文献74-79
• 致谢79-80
• 个人简历80

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