2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用研究

发布时间：2016-09-28 15:28

  本文关键词：天麻酚性成分对H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

《云南中医学院》 2013年

天麻酚性成分对H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用研究

文金隆  

【摘要】：目的：课题组前期研究证明天麻具有较强的抗脑缺血再灌注损伤作用，并提示其作用机制与抗氧化损伤有关，其活性为一组脂溶性酚性成分。本研究以H_2O_2诱导损伤PC12细胞为细胞氧化应激损伤模型，对天麻3个提取物和15份单体成分进行活性筛选，探讨天麻酚性成分对细胞氧化应激损伤的保护作用，并初步探讨其可能的作用机制。 方法： 1、采用RPMI-1640培养基、含10%FBS和0.4%双抗的常规培养条件对PC12细胞进行培养、传代和冻存，并以MTT法、细胞计数法和台盼蓝染色计数法绘制其生长曲线，初步掌握PC12细胞的体外生长增殖特性。 2、采用细胞形态学观察和MTT法测定细胞存活率作为评价指标，探讨研究用H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤模型的适宜浓度。 3、采用细胞形态学观察和MTT法测定细胞存活率作为评价指标，探讨研究用依达拉奉对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化损伤模型的有效浓度。 4、采用细胞形态学观察和MTT法测定细胞存活率作为评价指标，评价天麻3个提取物和15份单体成分对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化损伤模型的保护作用。 5、采用DCFH-DA荧光探针法、LDH酶标法、硫代巴比妥酸酶标法和T-SOD羟胺法，评价天麻活性成分对H_2O_2诱导的PC12细胞内ROS水平、细胞外LDH活性、LDH泄漏率、细胞内MDA含量和SOD活性的影响。 结果： 1、从MTT法绘制的生长曲线得出，在本实验室96孔板常规培养的条件下，PC12细胞数量以100个/mL接种培养6d未达到平台期，100000个/mL细胞接种3d即达到平台期，适宜的细胞接种浓度为6000、8000和10000个/mL细胞，确定选择8000个/mL细胞的接种浓度在25cm2培养瓶中培养，绘制培养瓶培养PC12细胞生长曲线。从细胞计数法和台盼蓝染色计数法绘制的生长曲线得出，以8000个/mL的细胞浓度接种在25cm2培养瓶中，培养到第4d长至约90%的覆盖率，第5d时长满，随着细胞数量的不断增多、生长空间减少，细胞发生接触抑制和密度抑制。 2、40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)的H_2O_2可使PC12细胞数量逐渐减少，多数细胞突起收回，胞体变圆，部分变圆细胞成团存在，胞体边缘模糊，折光性减弱，贴壁能力降低；与正常组比较，40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)的H_2O_2诱导PC12细胞存活率在18.6%-66.0%的损伤（P0.01），氧化损伤PC12细胞的H_2O_2适宜浓度范围在40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)。 3、依达拉奉在0.918mmol·L~(-1)（160μg·mL~(-1)）给药浓度下对50μmol·L~(-1)H_2O_2诱导PC12细胞损伤的形态改善最为明显。细胞存活率检测结果：与正常组比较，50μmol·L~(-1)H_2O_2损伤PC12细胞2h后的模型组细胞存活率为26.9%（P0.01）；与模型组比较，依达拉奉在给药浓度达到0.918mmol/L时提高细胞存活率10.9个百分点（P0.01）。 4、天麻3个提取物及15份单体中，天麻EtOAc（20μg·mL~(-1)）和8#（80μg·mL~(-1)）对50μmol·L~(-1)H_2O_2诱导PC12细胞损伤的形态改善最为明显。细胞存活率检测结果：与模型组比较，天麻EtOAc（20μg·mL~(-1)）和8#（80μg·mL~(-1)）分别提高细胞存活率14.7和9.9个百分点（P0.01），1#和6#也提高细胞存活率（P0.05或P0.01），其同浓度结果重复性差。 5、天麻EtOAc和8#对H_2O_2诱导的PC12细胞内ROS水平、细胞外LDH活性、LDH泄漏率、细胞内MDA含量和SOD活性测试结果表明，与模型组比较，天麻EtOAc（80μg·mL~(-1)）和8#（40、80μg·mL~(-1)）受试物组对细胞产生的荧光强度降低差异明显（P0.01）；天麻EtOAc （20、40、80μg·mL~(-1)）受试物组胞外的LDH活性明显低于模型组（P0.05或P0.01），LDH泄漏率降低差异明显（P0.05或P0.01），8#（40、80μg·mL~(-1)）受试物组胞外LDH活性明显高于模型组（P0.05或P0.01），提高LDH泄漏率的差异明显（P0.01）；天麻EtOAc（20、40、80μg·mL~(-1)）受试物组降低细胞内MDA含量的趋势明显，其中40μg·mL~(-1)组降低细胞内MDA含量的差异明显（P0.05）；天麻EtOAc（20、40μg·mL~(-1)）和8#（20、40μg·mL~(-1)）受试物组提高细胞内的T-SOD活性差异明显（P0.01），天麻EtOAc和8#的80μg·mL~(-1)给药组降低细胞内T-SOD活性差异明显（P0.01）。 结论： 1、在25cm2培养瓶中以8000个/mL（1600个/cm2）细胞悬液接种PC12细胞培养到第4d时的细胞最适宜细胞传代、接种和冻存，其群体倍增时间介于12h至24h之间。 2、采用40μmol·L~(-1)-80μmol·L~(-1)的H_2O_2损伤PC12细胞2h可复制PC12细胞氧化应激损伤模型。 3、依达拉奉对H_2O_2损伤PC12细胞2h造成氧化应激损伤模型的较佳保护浓度为0.918mmol·L~(-1)（160μg·mL~(-1)）。 4、天麻酚性成分8#、1#、6#和天麻EtOAc提取物具有改善氧化损伤PC12细胞的形态，提高模型细胞存活率的作用。 5、天麻EtOAc提取物具有保护H_2O_2损伤后细胞膜的完整性、降低损伤后细胞内ROS的水平、提高细胞内SOD活性和抑制脂质过氧化的作用；天麻酚性成分8#具有降低H_2O_2损伤后细胞内ROS的水平和提高细胞内SOD活性的作用，在所设剂量下不是通过保护细胞膜的完整性和降低脂质过氧化作用发挥其抗氧化损伤的作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R285
【目录】：

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  本文关键词：天麻酚性成分对H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤的保护作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：125607