二氢杨梅素激活AMPK对高糖诱导血管内皮细胞损伤的抑制作用研究

发布时间：2018-01-02 23:13

  本文关键词：二氢杨梅素激活AMPK对高糖诱导血管内皮细胞损伤的抑制作用研究　出处：《第三军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：最新研究资料显示我国18岁以上成年人糖尿病(diabetes mellitus,DM)的患病率高达11.6%,已成为继心脑血管疾病和肿瘤之后严重威胁我国居民健康的“第三杀手”。糖尿病患者常常由于其各种并发症而导致病残和死亡,其中最为常见的原因是血管病变,而血管内皮细胞遭受高糖损伤是发生糖尿病血管并发症的始动因素。基于此,严格控制血糖水平是防治糖尿病血管并发症的首选策略,然而现实生活中糖尿病患者的血糖控制有效率普遍偏低。因此,深入研究高糖损伤血管内皮细胞的作用机制及相应的保护措施具有重要的理论价值和应用前景。大量研究证据表明单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是防治糖脂代谢紊乱相关疾病的重要靶点,近年研究还发现AMPK信号通路对血管内皮细胞功能也有重要调节作用。AMPK是由催化亚基α和调节亚基β、γ组成的异源三聚体。AMPK上游激酶通过磷酸化α亚基的172位苏氨酸残基(Thr172)激活AMPK。研究发现糖原可通过结合β亚基上的糖原结合域(glycogen-binding domain,GBD),引起AMPK活性的变构抑制。糖原合成酶(glycogen synthase,GS)是调控糖原合成的关键酶,而蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)对GS活性具有重要调控作用。γ亚基可通过感知细胞内AMP/ATP比值的变化从而引起AMPK活性的变构调节。已有研究发现高糖对心肌细胞、内皮祖细胞的损伤作用与其抑制上述细胞的AMPK活性密切有关。但是,AMPK在高糖诱导血管内皮细胞损伤中的变化及其作用目前尚不清楚。藤茶(ampelopsis grossedentata)属于葡萄科植物家族中的分支蛇葡萄属,既可泡茶饮用又具药理作用,在我国中南部的山区分布较广,当地少数民族将鲜嫩的藤茶茎叶炮制后饮用已有几百年的历史,并发现其对上呼吸道感染及肝炎等病症有治疗作用。黄酮类化合物二氢杨梅素的含量在干藤茶中的比重高达25%左右,二氢杨梅素已被证实具有改善脂类代谢和对抗炎症、肿瘤等多种药理功效,同时也是藤茶作为保健饮品发挥作用的主要活性成分。在前期实验研究中我们证实杨梅素对高糖促发的血管内皮细胞氧化应激损伤具有保护作用。而二氢杨梅素的分子结构又与杨梅素极为相似,由此推测二氢杨梅素对高糖诱导血管内皮细胞损伤可能也具有保护效应。本研究通过高糖处理原代人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立高糖诱导的血管内皮细胞损伤体外模型,通过细胞活力测定、流式细胞分析、蛋白免疫印迹、蒽酮-硫酸比色法、实时荧光定量PCR、化学发光、ELISA等技术,探讨AMPK活性变化在高糖诱导血管内皮细胞损伤中的作用及其调节机制,以及二氢杨梅素干预对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用与机制,旨在为应用二氢杨梅素干预或饮用藤茶防治糖尿病血管并发症提供实验证据。主要研究结果和结论如下:1、在高糖作用下,HUVECs细胞活力明显下降,细胞凋亡率显著增加,而二氢杨梅素干预可明显抑制高糖诱导的HUVECs细胞活力下降和细胞凋亡增加,表明二氢杨梅素对高糖诱导HUVECs细胞损伤有明显的保护作用。2、高糖处理的HUVECs细胞中AMPK及其下游靶蛋白ACC的磷酸化水平(p-AMPK、p-ACC)显著降低,表明高糖抑制HUVECs细胞的AMPK活性。AMPK激动剂AICAR预处理可显著抑制高糖诱导的HUVECs细胞活力下降及细胞凋亡增加;相反,AMPK活性抑制剂compound C则明显抵消AICAR对高糖诱导的HUVECs细胞活力下降及细胞凋亡的保护作用,提示AMPK活性抑制参与了高糖诱导HUVECs损伤。3、与正常对照HUVECs细胞相比,二氢杨梅素处理的HUVECs细胞中的p-AMPK、p-ACC水平显著升高,且高糖处理的HUVECs细胞经二氢杨梅素干预后p-AMPK、p-ACC水平明显回升,表明二氢杨梅素可拮抗高糖对HUVECs细胞AMPK活性的抑制作用。此外,AMPK活性抑制剂compound C明显削弱二氢杨梅素对高糖诱导HUVECs细胞损伤的保护作用,提示二氢杨梅素通过激活AMPK抑制高糖诱导的HUVECs细胞损伤。4、高糖处理的HUVECs细胞与正常对照组细胞相比,细胞内糖原含量显著增加,GS m RNA及蛋白表达明显升高,同时Akt和GSK3β蛋白的表达及其磷酸化水平增加,提示高糖可能通过Akt-GSK3β-GS通路促进HUVECs细胞糖原合成继而抑制AMPK活性。5、二氢杨梅素处理的HUVECs与正常对照组细胞比较,细胞内ATP含量显著降低,同时ATP合成酶线粒体酶复合物F1F0-ATP合成酶活性明显下降,提示二氢杨梅素可能通过抑制ATP合成酶活性降低细胞内ATP的含量,继而激活AMPK。综上所述,高糖通过Akt-GSK3β-GS通路增加HUVECs细胞内糖原含量抑制其AMPK活性,继而引起HUVECs细胞损伤,而二氢杨梅素干预可通过抑制HUVECs细胞线粒体酶复合物F1F0-ATP合成酶活性、降低ATP的含量增加其AMPK活性,从而拮抗高糖对HUVECs细胞AMPK活性的抑制作用并保护高糖诱导的HUVECs细胞损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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本文编号：1371337