三草颗粒治疗肝硬化的作用及机制研究

发布时间：2018-02-14 11:03

本文关键词： 三草颗粒网络药理学肝硬化药效机制　出处：《成都中医药大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：通过网络药理学方法,筛选并预测医院制剂“三草颗粒”对肝纤维化治疗作用的活性成分及作用靶点,再通过实验研究进一步验证“三草颗粒”对肝硬化及肝纤维化的影响及其作用机制,为临床用药提供理论依据。方法：①采用网络药理学方法,筛选并预测三草颗粒治疗肝纤维化的活性成分及作用靶点。②通过CCL4联合BSA诱导的肝硬化模型,观察三草颗粒对肝硬化的治疗作用。③通过硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型,考察三草颗粒对肝纤维化的治疗作用。④通过猪血清诱导的肝纤维化模型,并采用免疫组化法检测α-SMA和TGF-β1;蛋白印迹法检测a-SMA、TGF-β1、p-Smad3、Smad7、TLR4、MyD88和NF-κB; RT-PCR检测TGF-β1、HMGB1和TLR4,考察三草颗粒对肝纤维化的治疗作用及相关机制。⑤采用液质联用技术,鉴别三草颗粒中的有效化学成分。结果：(1)采用网络药理学方法成功预测三草颗粒治疗肝纤维化的活性成分及相关作用靶点基于三草颗粒中各味中药及肝纤维化相关数据库,共筛选出三草颗粒中68个化学成分和387个靶点蛋白,59个肝纤维化相关疾病蛋白靶点,440个交互蛋白。三草颗粒各药物中,茜草有16个化学成分和51个靶点；稀莶草有24个化学成分和75个靶点；秦艽有2个化学成分和3个靶点；丹参有4个化学成分和82个靶点；连翘有11个化学成分和108个靶点；甘草有11个化学成分和68个靶点。通过网络药理学方法筛选出11个活性化学成分和16个直接作用蛋白靶点。预测得出的网络中各个节点的三个拓扑参数"Degree", "Betweenness centrality"和" Closeness centrality "的中位数平均值的2倍值分别为3.02、0.41和0.07,满足大于等于以上三个参数值条件的靶点蛋白有Amyloid beta A4 protein、Actin, cytoplasmic 1、 Transforming growth factor beta-1和Fibroblast growth factor 2。采用ArrayTrack v.3.5.0对三草颗粒治疗肝纤维化进行KEGG通路富集分析,共筛选出22条通路,在这22条通路中TGF-beta signaling pathway、P53 signaling pathway、MAPK signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway和Chemokine signaling pathway都可以直接或间接参与免疫和炎症反应,或者扮演其他与肝纤维化相关的重要作用。其中TGF-β1参与了上述大多数通路,如Pathways in cancer、Pancreatic cancer. Chronic myeloid leukemia、Cytokine-cytokine receptor interaction、Cell cycle、Adherens junction和TGF-beta signaling pathway。所以选择TGF-β1和其通路下游分子蛋白Smad3和Smad7作为进一步深入研究的对象。(2)三草颗粒对CCL4联合BSA诱导的肝硬化模型大鼠的干预作用与正常对照组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST、TB、HA、LN和IVC水平显著升高(P0.01),ALB水平显著降低(P0.01)；与模型组相比,熊去氧胆酸组和三草颗粒各剂量组大鼠血清中ALT、AST、TB、HA、LN和IVC水平明显降低(P0.05或P0.01),此外高、中剂量组大鼠血清中ALB水平明显升高(P0.01)。组织病理学也表明,三草颗粒各剂量组均能改善大鼠肝组织内胶原含量及炎症程度。(3)三草颗粒对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型大鼠的改善作用与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST、TB、HA、LN和IVC的水平显著升高(P0.01), ALB水平显著降低(P0.01)；与模型组相比,熊去氧胆酸组和三草颗粒高、中剂量组大鼠血清中ALT、AST、TB、HA、LN和IVC水平明显降低(P0.05或P0.01), ALB水平显著升高(P0.01)。组织病理学也表明,三草颗粒各剂量组均能改善大鼠肝组织内胶原含量及炎症程度。(4)三草颗粒对猪血清诱导的肝纤维化模型大鼠的影响机制与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST、TB、HA、LN和IVC的水平显著升高(P0.01), ALB水平显著降低(P0.01)；与模型组相比,熊去氧胆酸组和三草颗粒各给药剂量组大鼠血清中ALT、AST、TB、HA、LN和IVC水平显著降低(P0.01), ALB水平显著升高(P0.01)。组织病理学也表明,三草颗粒各剂量组均能改善大鼠肝组织内胶原含量及炎症程度。免疫组化结果表明：与正常组相比,模型组大鼠肝组织中的α-SMA和TGF-β1蛋白表达量显著增加；而三草颗粒各给药组大鼠肝组织中α-SMA和TGF-β1蛋白表达较模型显著减少：蛋白印迹结果表明：模型组大鼠肝组织中α-SMA、 TGF-β1、p-Smad3、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达量明显增加(P0.01)；与模型组大鼠相比,三草颗粒各给药组大鼠肝组织中蛋白表达量显著降低(P0.01); RT-PCR结果表明：与正常组大鼠相比,模型组大鼠肝组织中TGF-β1、 HMGB1和TLR4蛋白mRNA表达水平显著升高(P0.01)；与模型组相比,三草颗粒各给药组大鼠肝组织中TGF-β1、HMGB1和TLR4蛋白mRNA表达水平显著降低(P0.01)。(5)三草颗粒主要化学成分的鉴定采用TOF LC/MS/MS技术,通过分析化合物的保留时间、精确分子量、一级谱和二级谱,我们共鉴定出15个化学成分,分别为：大叶茜草素、羟基茜草素、龙胆苦苷、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、丹参素、甘草酸、甘草次酸、隐丹参酮、芒柄花黄素、阿魏酸、獐牙菜苦苷、当药甘和荭草素。结论：①网络药理学预测出三草颗粒中共11个化学成分可能是三草颗粒治疗肝纤维化的活性化合物,16个直接作用靶点可能是三草颗粒治疗肝纤维化可能的靶点蛋白。TGF-β1/Smad可能是三草颗粒治疗肝纤维化最重要的信号通路。②三草颗粒能明显降低大鼠血清中AST/ALT、TB、HA、LN和IVC水平,明显升高ALB水平；明显改善大鼠肝组织病理状态,改善大鼠肝硬化及肝纤维化程度。③三草颗粒明显改善肝损伤及肝纤维化的机制与降低肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA、CTGF、HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1、p-Smad3、Smad7蛋白表达量,明显降低肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1、HMGB1和TLR4在mRNA水平的表达相关。④三草颗粒中主要化学成分为大叶茜草素、羟基茜草素、龙胆苦苷、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、丹参素、甘草酸、甘草次酸、隐丹参酮、芒柄花黄素、阿魏酸、獐牙菜苦苷、当药甘和荭草素。综上所述：本研究结果表明三草颗粒治疗肝硬化及肝纤维化疗效显著,明显减少肝脏中胶原含量,其作用机制可能是药物通过作用于HMGB1/TLR4/NF-κB和TGF-β1/Smad信号传导通路实现的。
[Abstract]:Objective : To screen and predict the effect of Sancao Granule on liver fibrosis by means of network pharmacology . There were 22 pathways in which TGF - 尾1 was involved in most of the above - mentioned pathways , such as metastasis in cancer and breast cancer . The levels of ALT , AST , TB , HA , LN and IVC in serum of model group were significantly lower than those in normal control group ( P0.01 ) . Compared with the normal group , the levels of ALT , AST , TB , HA , LN and IVC were significantly decreased ( P0.01 ) . ( 5 ) Identification of the main chemical constituents of the three grass particles adopts TOF LC / MS / MS technology , and 15 chemical components are identified by analyzing the retention time , exact molecular weight , primary spectrum and secondary spectrum of the compound . In conclusion , the results showed that Sancao Granule was effective in the treatment of liver cirrhosis and hepatic fibrosis .

【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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