复方芪麻胶囊对高血压血管内皮保护机制及应用研究

发布时间：2018-10-09 16:10

【摘要】：第一部分临床研究目的：通过临床观察复方芪麻胶囊对气虚痰浊型高血压患者中医症状积分、血压、血流介导的内皮依赖性舒张功能(FMD)、血管紧张素Ⅱ及内皮微颗粒(EMPs)水平的影响,探讨复方芪麻胶囊的临床降压疗效及其对高血压患者的血管内皮保护作用。方法：选取1级、2级气虚痰浊型原发性高血压患者80例,随机分为对照组及治疗组各40例,对照组予以硝苯地平控释片口服,治疗组在对照组基础上加用复方芪麻胶囊口服,疗程均为2个月。观察治疗前后患者中医症状积分、血压、肱动脉血流介导的舒张功能(FMD)、血管紧张素II (AngⅡ)及血浆内皮微颗粒水平(EMPs)的变化。结果：(1)共有74例患者完成研究,其中对照组36例,治疗组38例,治疗前两组患者在性别、年龄、病程、血压级别、中医症状积分、FMD、AngⅡ及EMPs水平方面比较,差异无统计学意义(PO.05)。(2)两组在改善中医症状积分方面比较：治疗后,两组中医症状积分均较治疗前显著下降(PO.05),治疗组中医症状积分差值及总有效率显著高于对照组(PO.05)。(3)两组的降压疗效比较：治疗后,两组SBP及DBP均较治疗前显著下降(P0.05)；治疗组患者治疗前后SBP差值(即SBP下降幅度)显著高于对照组(P0.05),DBP下降幅度则无显著差异(P0.05)。(4)两组对FMD影响的比较：两组FMD水平均较治疗前显著上升(P0.05),但治疗组FMD水平的升高程度显著高于对照组(PO.05)。(5)两组对AngⅡ水平影响的比较：与治疗前相比,对照组AngⅡII平无显著变化(PO.05)；治疗组的AngⅡ水平较治疗前显著下降且下降程度也显著高于对照组(P0.05)。(6)两组对血浆EMPs水平影响的比较：两组EMPs水平均较治疗前显著下降(P0.05),但治疗组EMPs水平的下降程度显著高于对照组(P0.05)。结论：(1)复方芪麻胶囊不仅能够降压,而且可以改善气虚痰浊型高血压患者的临床症状；(2)复方芪麻胶囊具有降低内皮损伤因子EMPs及AngⅡ的能力,以发挥保护内皮功能的作用。第二部分实验研究实验一：复方芪麻胶囊对高血压大鼠血管内皮损伤的作用机制研究目的：观察复方芪麻胶囊对自发性高血压大鼠血压、血管内皮活性物质(NO、ET-1及AngⅡ)、氧化应激相关因子(SOD及MDA)和主动脉血管内皮形态学的影响,探讨复方芪麻胶囊对高血压血管内皮发挥保护作用的可能机制。方法：随机将50只14周龄的自发性高血压大鼠(SHR)分为SHR组(给予蒸馏水,10ml/Kg/d)、硝苯地平组(硝苯地平,2.7mg/Kg/d)、硝苯地平+芪麻组(硝苯地平,2.7mg/Kg/d+复方芪麻胶囊,0.9288g/Kg/d)、芪麻高剂量组(复方芪麻胶囊,3.7125g/Kg/d)和芪麻低剂量组(复方芪麻胶囊,0.9288g/Kg/d),每组10只,以WKY大鼠10只作为正常对照(给予蒸馏水,10ml/Kg/d),每日灌胃一次,各组大鼠在初次给药前及给药后每2周分别采用无创尾动脉测压法进行测压,给药时间为8周。8周后,进行腹主动脉取血,收集并检测血清中NO、ET-1、AngⅡ、SOD和MDA的水平。取lcm长的主动脉组织行HE染色并于倒置显微镜下观察其组织形态,并分别采用qRT-PCR及Western Blot技术检测主动脉组织中eNOS、NOX4及Sirtl在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：(1)血压水平比较：①从第2周开始,硝苯地平组SBP和DBP水平就显著低于SHR组(P0.05),硝苯地平+芪麻组SBP也显著低于SHR组(P0.05)；从第4周开始,其余各组SBP及DBP均低于SHR组,差异有统计学意义(P0.01或PO.05)。②从第2周开始,与治疗前相比,硝苯地平组及硝苯地平+芪麻组,SBP及DBP出现明显下降,差异有统计学意义(P0.01)；芪麻高剂量组,从第4周开始SBP及DBP出现显著下降(P0.01)；芪麻低剂量则从第8周开始出现显著下降(P0.01)。(2)血清NO水平比较：与WKY组相比,其余各组血清NO水平明显下降,差异有统计学意义(P0.01)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组血清NO水平显著上升(P0.01)；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量血清NO水平明显上升(P0.05)；但硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量血清NO水平无显著差异(P0.05)。(3)血清ET-1水平比较：与WKY组相比,SHR组血清ET-1水平显著升高(P0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组及芪麻低剂量组ET-1水平显著下降(P0.05)；硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组组间两两比较,差异无统计学意义(P0.05)。(4)血清AngⅡ水平比较：与WKY组相比,SHR组血清AngⅡ水平显著升高(P0.01)；与SHR组相比,硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组及芪麻高剂量组AngⅡ水平显著下降(P0.05),芪麻低剂量组AngⅡ均数水平较SHR组有所下降,但差异无统计学意义(P0.05)。(5)血清MDA水平比较：与WKY组相比,SHR组血清MDA显著升高(P0.01)；与SHR组相比,各组MDA水平显著下降(PO.05),与硝苯地平组相比,芪麻高剂量组MDA水平显著下降(P0.05)。(6)血清SOD水平比较：与WKY组相比,SHR组、硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组及芪麻低剂量组血清SOD显著下降(P0.01)；与SHR组相比,各治疗组SOD水平显著升高(PO.01)；与硝苯地平组相比,芪麻高剂量组SOD水平显著升高(P0.05)。(7)主动脉形态学比较：WKY组大鼠主动脉内膜光滑,内皮细胞完整,中膜平滑肌细胞排列整齐；SHR组主动脉内膜连续性被破坏,内皮细胞可见局部缺损,中膜平滑肌细胞排列不规则；硝苯地平组可见主动脉内膜光整性欠佳,中膜平滑肌细胞排列整齐；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组、芪麻低剂量组主动脉壁各层细胞排列规则,内皮细胞未见明显局部缺损或增厚。(8)主动脉eNOS mRNA水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组、硝苯地平组eNOS mRNA表达显著下降(P0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS mRNA表达水平显著升高(PO.05)；硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS mRNA表达水平两两比较,差异无统计学意义(P0.05)。(9)主动脉Sirtl mRNA水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组、硝苯地平组Sirtl mRNA表达显著下降(P0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl mRNA表达水平显著升高(PO.05)；硝苯地平组、硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl mRNA表达水平差异无统计学意义(P0.05)。(10)主动脉eNOS蛋白水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组及硝苯地平组eNOS蛋白表达水平显著下降(P0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS蛋白的表达水平显著升高(P0.05)；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组eNOS蛋白的表达水平显著升高(PO.05)。(11)主动脉NOX4蛋白水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组NOX4蛋白水平表达显著升高(P0.05)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组NOX4蛋白水平表达显著降低(P0.05)；与硝苯地平组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组NOX4蛋白水平的表达显著降低(P0.05)。(12)主动脉Sirtl蛋白水平表达的比较：与WKY组相比,SHR组Sirtl蛋白水平的表达显著下降P0.01)；与SHR组相比,硝苯地平+芪麻组、芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl蛋白水平的表达水平显著升高(P0.05)；与硝苯地平组相比,芪麻高剂量组及芪麻低剂量组Sirtl蛋白水平的表达水平显著升高(PO.05)。结论：(1)自发性高血压大鼠存在内皮结构和功能的障碍；(2)复方芪麻胶囊能够增加SHR血清NO并降低ET-1及AngⅡ水平调节内皮依赖性血管舒张功能；(3)复方芪麻胶囊能够通过增加SHR血清SOD并降低MDA水平提高内皮细胞抗氧化应激能力；(4)复方芪麻胶囊具有保护SHR主动脉内皮结构的作用；(5)硝苯地平与复方芪麻胶囊两药联用可发挥更好的降压及保护血管内皮的优势；(6)复方芪麻胶囊可能通过上调主动脉内皮细胞Sirt1、eNOS的表达促进NO的合成释放,并通过抑制NOX4的表达降低氧化应激反应,从而起到保护血管内皮的作用。实验二：复方芪麻胶囊含药血清对AngⅡ诱导损伤HUVECs的保护作用及机制研究目的：利用AngⅡ刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立内皮细胞损伤模型,观察复方芪麻胶囊含药血清对细胞凋亡及NO、ROS合成的影响,探讨复方芪麻胶囊对Sirt1、 eNOS及NOX4的调控途径,从细胞水平揭示其改善高血压内皮细胞损伤潜在的分子机制。方法：(1)用MTT法检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs)被不同浓度AngⅡ(10-8mol/L、 10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L)干预一定时间(12h、24h、48h)后的细胞活性情况,最终确定建立HUVECs损伤模型的AngⅡ浓度为10-6mol/L,作用时间为24h。(2)用MTT法检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs)被不同浓度复方芪麻胶囊含药血清(5%、10%、20%)干预一定时间(12h、24h、48h)后的细胞活性变化,最终表明5%、10%、20%复方芪麻胶囊含药血清均无细胞毒性。(3) HUVECs分组培养(①空白组；②模型组；③5%复方芪麻胶囊含药血清组；④10%复方芪麻胶囊含药血清组；⑤20%复方芪麻胶囊含药血清组；⑥阿托伐他汀钙组),24h后收集细胞或上清进行相关实验检测。(4)用MTT法检测各组HUVECs的活性。(5)在倒置显微镜观察各组HUVECs的形态学变化。(6)用硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养基中一氧化氮(NO)的浓度。(7)用流式细胞技术检测各组HUVECs的活性氧水平及细胞凋亡率情况。(8) qRT-PCR技术检测各组HUVECs中eNOS、NOX4及Sirtl在mRNA水平的表达情况。(9) Western Blot技术检测各组HUVECs中eNOS、NOX4及Sirtl在蛋白水平的表达情况。结果：(1)细胞活性比较：与空白组相比,模型组细胞活性显著降低(PO.01)；与模型组相比,各浓度复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组的细胞活性显著升高(P0.01)。(2)细胞形态学观察：空白组内皮细胞呈扁平状圆形或梭状铺路石状排列,核仁明显,轮廓清晰；模型组多数细胞皱缩呈圆形或椭圆形,细胞间间隙变大,核仁显示不清；复方芪麻胶囊含药血清组中部分细胞皱缩呈圆形或椭圆形,细胞间联系较紧密,核仁较清晰,其中10%复方芪麻胶囊含药血清细胞形态较低浓度含药血清的细胞形态改善；经阿托伐他汀钙处理的细胞形态与正常组相似。(3)NO水平的比较：与空白组相比,其余各组的细胞培养基中NO水平显著降低(P0.01)；与模型组相比,各浓度复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组培养基中NO水平显著升高(P0.05)；各药物干预组中,NO含量以10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组最高,其次为20%复方芪麻胶囊含药血清组,最低为5%复方芪麻胶囊含药血清组(PO.05)。(4) HUVECs内ROS水平的比较：与空白组相比,其余各组的细胞内ROS含量显著升高(P0.01)；与模型组相比,各药物干预组的ROS含量显著降低(P0.05)；各药物干预组间的ROS含量均存在显著差异,其中10%复方芪麻胶囊含药血清组细胞内ROS含量最低,其次是阿托伐他汀钙组,再次是20%复方芪麻胶囊含药血清组,ROS含量最高为5%复方芪麻胶囊含药血清组(PO.05)。(5)HUVECs凋亡水平的比较：与空白组相比,其余各组凋亡率显著升高(P0.01)；与模型组相比,各药物干预组的细胞凋亡率显著降低(PO.01)；各药物干预组间的细胞凋亡率也存在显著差异,其中10%复方芪麻胶囊含药血清组与阿托伐他汀钙组的细胞凋亡率最低(P0.05),其次是20%复方芪麻胶囊含药血清组,细胞凋亡率最高为5%复方芪麻胶囊含药血清组(P0.01)。(6) eNOS mRNA水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞eNOS mRNA表达显著下降(P0.05)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组eNOS mRNA表达水平显著升高(P0.01)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组eNOS mRNA表达显著下降(P0.05); apocynin组及sirtinol组两者eNOS mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。(7) NOX4 mRNA水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞NOX4 mRNA表达显著升高(P0.01)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及apocynin组NOX4 mRNA表达水平显著降低(P0.01), sirtinol组NOX4 mRNA表达水平显著升高(P0.01)；与sirtinol组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及apocynin组NOX4 mRNA表达水平显著降低(O0.01)。(8)Sirtl mRNA水平表达的比较：与空白组相比,模型组、apocynin组及sirtinol组Sirtl mRNA表达显著下降(P0.05)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组Sirtl mRNA表达水平显著升高(P0.01), sirtinol组Sirtl mRNA表达水平显著降低(P0.05)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组Sirtl mRNA表达显著降低(P0.05)；与apocynin组相比,sirtinol组Sirtl mRNA表达水平显著降低(P0.05)。(9) eNOS蛋白水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞eNOS蛋白水平表达显著下降(P0.01)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组eNOS蛋白水平表达显著升高(P0.01),sirtinol组eNOS蛋白水平表达显著降低(P0.01)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组Sirtl蛋白水平表达显著降低(P0.05)；与sirtinol组相比,apocynin组eNOS蛋白水平表达显著升高(P0.01)。(10)NOX4蛋白水平表达的比较：与空白组相比,模型组、10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及sirtinol组细胞NOX4蛋白水平表达显著升高(P0.01)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组、阿托伐他汀钙组及apocynin组NOX4蛋白表达显著降低(P0.01),sirtinol组NOX4蛋白水平表达显著升高(P0.01)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,sirtinol组NOX4蛋白水平表达显著升高(P0.01)；与sirtinol组相比,apocynin组NOX4蛋白水平表达显著降低(P0.01)。(11) Sirtl蛋白水平表达的比较：与空白组相比,各组细胞Sirtl蛋白水平表达显著下降(P0.05)；与模型组相比,10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组Sirtl蛋白水平表达显著升高(P0.01),sirtinol组Sirtl蛋白水平表达显著降低(P0.05)；与10%复方芪麻胶囊含药血清组及阿托伐他汀钙组相比,apocynin组及sirtinol组Sirtl蛋白水平表达显著降低(P0.05)；与sirtinol组相比,apocynin组Sirtl蛋白表达显著升高(P0.05)。结论：(1) 10-6mol/L浓度的AngⅡ干预24h可用于制作HUVECs的损伤模型。(2)复方芪麻胶囊含药血清可以改善受损的HUVECs的细胞形态,其中以10%浓度效果最佳。(3)复方芪麻胶囊含药血清能够明显提高HUVECs培养基中NO的水平,并抑制ROS的产生以减轻氧化应激对细胞造成的损伤,其中以10%浓度效果最佳。(4)复方芪麻胶囊含药血清能够明显抑制HUVECs的凋亡,其中以10%浓度干预后的细胞凋亡率最低。(5) AngⅡ能够抑制HUVECs中eNOS及Sirtl的表达并促进NOX4的表达,从而对内皮细胞造成损伤；(6)复方芪麻胶囊及阿托伐他汀钙能够通过上调人脐静脉内皮细胞eNOS及Sirtl的表达水平并抑制NOX4表达对内皮细胞起保护作用;(7)复方芪麻胶囊可能通过促进上游基因Sirtl的表达,在上调eNOS促进NO生成的同时下调NOX4减少ROS的产生,保护内皮细胞功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

【参考文献】