电针预处理对MCAO模型大鼠脑内稳态调节及生物学机制研究

发布时间：2020-03-24 10:22

【摘要】：目的流行病学调查显示,目前中国脑卒中死亡的人数已超过肿瘤和心血管病,位于致死原因的首位。本研究借助大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型,按照“标本配穴”法原则,以“百会”为“标穴”,醒神开窍,以“肾俞”、“三阴交”为“本穴”,补益肝肾、通经活络,观察电针预处理对MCAO模型大鼠的海马组织中炎症、氧化、凋亡的影响,并以丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路为主线探索调节内环境稳态的平衡机制,为临床“标本配穴”法的应用,以及电针预处理干预脑缺血再灌注损伤(CIRI)相关性疾病提供重要的理论基础和指导方向。方法SPF级雄性SD大鼠128只,适应性喂养一周,随机分为正常组(Control group),假手术组(Sham group)、大鼠脑中动脉缺血组(MCAO group)和电针预处理组(EA+MCAO group);大鼠大脑中动脉缺血组采用线拴法复制MCAO模型;电针预处理组先进行电针预处理一小时,大鼠休息0.5h后再制作MCAO模型;假手术组除不插硅胶线阻塞血管外,其余操作与大鼠脑中动脉缺血组相同;正常组不给予任何处理。1、大鼠神经功能损伤评分:分别对造模后3h,6h,12h,24h四个时间点的大鼠进行神经功能缺损评分;2、形态学观察:MCAO模型大鼠于造模后6h取材,Triphenyltetra zolium chloride(TTC)染色检测脑梗死的体积,HE染色观察海马神经元的显微结构,透射电镜观察海马组织神经元的超微结构;3、炎症因子的检测:MCAO模型大鼠于造模后6h取材,免疫组化检测海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,Elisa检测海马组织TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;4、氧化应激指标的检测:MCAO模型大鼠造模后6h取材,透射电镜观察海马神经元线粒体超微结构,免疫组化法检测海马组织细胞色素C(Cyt-c)表达,Elisa法检测海马组织脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的表达;5、凋亡通路因子的检测:免疫组化检测海马组织裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的表达,WB检测海马组织Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达;6、MAPK家族蛋白表达的检测:WB检测海马组织中MAPK通路相关蛋白的表达,计算三条并行通路ERK,JNK,P38MAPK的非磷酸化和磷酸化比值。结果1、电针预处理对再灌注6h的MCAO模型大鼠的干预效果最为显著再灌注3h,6h,12h,24h后,对各组大鼠神经功能损伤进行评分,结果显示,与同一时间点的大鼠中动脉缺血组相比,电针预处理在缺血再灌注6h,对大脑损伤的干预效果最显著,因此在后续实验研究中将再灌注6h作为电针预处理机制研究的观测点。2、电针预处理减轻MCAO模型大鼠海马神经元的形态学异常⑴电针预处理减少脑梗塞的体积。TTC染色深红色区域为正常组织,而TTC染色白色区域为梗死区域。染色结果显示正常组和假手术组未出现明显白色区域;MCAO组大鼠脑组织出现大面积白色梗死灶;与大鼠脑中动脉缺血组相比,电针预处理组梗死体积明显减少,白色区域明显较小(P0.05)。⑵电针预处理可以减轻MCAO模型大鼠的海马神经元损伤。HE染色显示正常组和假手术组大鼠的海马神经元形态上未出现明显异常;大鼠脑中动脉缺血组大鼠海马神经元细胞排列紊乱,胞体内可见大量空泡,细胞核溶解甚至消失,大量细胞退行性坏死;电针预处理组大鼠海马组织神经元细胞排列欠整齐,细胞质中可见少量空泡,核膜皱缩。⑶电针预处理可以减轻大鼠海马神经元细胞器的损伤。透射电镜显示正常组和假手术组大鼠海马组织神经元细胞膜完整,平滑,细胞器结构正常;中动脉阻塞组大鼠海马神经元细胞可见细胞膜中断,细胞核核膜破裂,核染色质逐渐向中央集聚成轮廓不规则的团块,线粒体出现大量肿胀甚至溶解;电针预处理组大鼠海马神经元细胞膜欠完整,核染色质部分聚集,线粒体稍肿胀,可见部分线粒体嵴。3、炎症相关指标的检测⑴Elisa检测TNF-α、IL-1β的表达正常组和假手术组海马组织TNF-α、IL-1β的含量进行比较,结果提示差异没有统计意义(P0.05);大鼠脑中动脉缺血组与假手术组比较,显示TNF-α、IL-1β含量增加,差异有统计意义(P0.05);电针预处理组与大鼠脑中动脉缺血组比较,电针预处理可见TNF-α、IL-1β表达明显减少,差异有统计意义(P0.05)。⑵免疫组化检测TNF-α的表达正常组和假手术组海马组织TNF-α的表达,差异没有统计意义(P0.05);与正常组和假手术组比较,结果提示大鼠脑中动脉缺血组合电针预处理组TNF-α表达明显增加,差异有统计意义(P0.05);电针预处理组与大鼠脑中动脉缺血组比较,可见TNF-α的阳性细胞表达明显减少,差异有统计意义(P0.05)。4、氧化应激相关指标的检测⑴电针预处理减轻模型大鼠海马神经元线粒体肿胀和空泡率线粒体是细胞进行电子氧化、产生能量的结构单位,正常组和假手术组的线粒体结构未见明显异常;大鼠脑中动脉缺血组出现线粒体损伤化的特征性征象,如缺乏典型的管状或椭圆形形态,双膜结构消失,空泡化,线粒体嵴中断甚至消失;电针预处理组也可见线粒体明显改变,线粒体嵴肿胀、形态呈圆形。⑵电针预处理减少模型大鼠海马组织Cyt-c表达Cyt-c为生物氧化过程中的电子传递体,电子传递增加,会消耗大量氧原子,产生大量氧自由基;正常组和假手术组Cyt-c的阳性细胞表达数没有统计学意义(P0.05);电针预处理组和大鼠脑中动脉缺血组显示Cyt-c阳性细胞数表达较假手术组明显增加。电针预处理组与大鼠脑中动脉缺血组比较,Cyt-c表达有所减少,组间差异有统计意义(P0.05)。⑶电针预处理调节模型大鼠海马组织MDA、SOD、GSH的表达氧化应激产物MDA在正常组和假手术组比较,差异没有统计意义(P0.05);电针预处理组和大鼠脑中动脉缺血组的MDA含量与假手术组的MDA含量比较,差异有统计意义(P0.05);电针预处理组可见MDA的含量较大鼠脑中动脉缺血组明显减少,差异有统计意义(P0.05)。抗氧化因子SOD、GSH在正常组和假手术组比较,差异没有统计意义(P0.05);大鼠脑中动脉缺血组与正常组和假手术组比较,显示SOD、GSH减少,差异有统计意义(P0.05);电针预处理组可见SOD、GSH较大鼠脑中动脉缺血组明显增加,差异有统计意义(P0.05);5、凋亡相关指标检测的表达⑴免疫组化和WB检测Bax、Bcl-2的表达Bcl-2/Bax在正常组和假手术组间进行比较,差异没有统计学意义(P0.05);大鼠脑中动脉缺血组与假手术组比较,Bax增加,Bcl-2减少,Bcl-2/Bax下调,差异有统计学意义(P0.05);与大鼠脑中动脉缺血组比较,电针预处理组Bax减少,Bcl-2增加,Bcl-2/Bax较大鼠脑中动脉缺血组上调,差异有统计学意义(P0.05)。⑵免疫组化和WB检测Cleaved Caspase-3的表达Cleaved Caspase-3在正常组和假手术组内的表达,差异没有统计学意义(P0.05);与正常组和假手术组比较,大鼠脑中动脉缺血组Cleaved Caspase-3增加,差异有统计学意义(P0.05);与大鼠脑中动脉缺血组比较电针预处理组Cleaved Caspase-3减少,差异有统计学意义(P0.05)。6、MAPK家族蛋白的表达⑴与假手术组比较,大鼠脑中动脉缺血组和电针预处理组pERK/ERK上调,差异有统计学意义(P0.05);但是大鼠脑中动脉缺血组和电针预处理组两组间没有差距,差异没有统计学意义(P0.05)。⑵p-JNK/JNK在四组间的表达没有明显差距,差异没有统计学意义(P0.05)。⑶p-P38MAPK/P38MAPK在大鼠脑中动脉缺血组和电针预处理组较正常组和假手术组都明显上调,差异有统计学意义(P0.05);而电针预处理组明显低于大鼠脑中动脉缺血组,差异有统计学意义(P0.05)。结论1、电针预处理可以减少MCAO模型大鼠的脑梗死体积,减轻神经元的病变程度。2、电针预处理能抑制促炎因子TNF-α、IL-1β的表达,控制炎性反应,减轻脑缺血再灌注的损伤。3、电针预处理可减轻线粒体的损伤,抑制Cyt-c的表达,通过调节氧化和抗氧化因子的失衡,发挥神经保护的作用。4、电针预处理可以调节海马组织Bcl-2/Bax的失衡,减少Cleaved Caspase-3的表达,进而抑制神经细胞凋亡,减轻脑缺血再灌注的损伤。5、电针预处理通过调节MAPK家族蛋白中p-P38MAPK与P38MAPK的比例,调节脑内病理过程的平衡,起到保护脑神经元的作用。
【图文】：

硅胶,大鼠,血管,百会

图 1-1 大鼠 MCAO 模型制作除不插硅胶线阻塞血管外，其它操作与大鼠脑理方式ml/100g 腹腔注射 5%戊巴比妥钠溶液进行麻醉处理针刺方法：参照中国针灸学会实验针灸研究会穴位图谱》标准[15]取穴（图 1-2），，取大鼠“百会23)、“三阴交穴”(SP6)。“百会穴”(GV20)：顶骨前或后平刺 2mm；“双侧肾俞穴”(BL23)：第二

示意图,百会,三阴交,电针

百会(GV20)、肾俞(BL23)、三阴交(SP6)
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245.97;R-332

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