温针灸联合骨髓间充质干细胞移植对兔膝骨关节炎软骨组织影响的研究

发布时间：2020-04-14 01:54

【摘要】：目的:本实验采用温针灸联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗兔膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA),探讨温针灸联合BMSCs移植对兔KOA软骨组织损伤的保护作用,并进一步探讨其作用机制。方法:选取新西兰大耳兔50只,雌雄各半,随机分成5组:空白组、模型组、温针灸组、BMSCs组、温针灸联合BMSCs组,每组10只。除空白组外其余4组均采用右后肢伸直位固定6周复制兔KOA中期软骨退变模型,并用X线检查造模是否成功,待造模成功后分别予以相应的干预手段,7天为一个疗程,共2个疗程,疗程结束后五组实验兔同时取材。采用改良LequesneMG膝关节评估量表对各组兔患侧膝关节行为学进行评分,彭太平法大体观察兔KOA软骨组织形态学变化,苏木精-伊红、番红-固绿、甲苯胺蓝染色法对兔KOA关节软骨组织进行病理观察,透射电镜观察软骨细胞超微结构及凋亡小体,TUNEL法观察软骨组织中细胞凋亡情况,免疫组化法与qPCR法观察各组关节软骨组织中凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况。所得最终实验数值采用SPSS20.0统计学软件分析。结果:1.温针灸联合BMSCs对兔KOA软骨组织损伤的保护作用与空白组相比,模型组兔患侧膝关节肿胀,活动范围明显减少,LequesneMG评分显著增加(P0.01),软骨组织病理损伤严重,HE染色Mankin’s评分显著升高(P0.01),番红-固绿、甲苯胺蓝染色见大面积失染,电镜观察超微结构见软骨细胞发生退变,细胞外血管坍塌,局部可见多个凋亡小体。与模型组相比,经温针灸、BMSCs、温针灸联合BMSCs治疗后,关节功能有所恢复,症状减轻,LequesneMG评分明显降低(P0.01),软骨组织病理损伤程度改善(P0.01),透射电镜见软骨细胞损伤有所恢复,外周血管略水肿,但血运逐渐恢复,可见少量红细胞。且温针灸联合BMSCs对上述指标的改善作用均优于单纯温针灸与单纯BMSCs移植治疗(P0.05)。2.温针灸联合BMSCs对兔KOA软骨组织损伤的保护作用机制与空白组相比,模型组TUNEL阳性软骨细胞数量显著增多(P0.01),且全层可见,软骨细胞中Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表达显著升高(P0.01),Bcl-2蛋白及mRNA表达降低(P0.01);与模型组相比,经温针灸联合BMSCs治疗后可以显著减少软骨细胞凋亡的数量(P0.01),软骨组织中凋亡相关因子表达明显改善,其中Bcl-2蛋白及mRNA表达显著升高,Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表达显著降低(P0.01)。结论:1.温针灸联合BMSCs移植能够有效抑制兔KOA软骨组织损伤,且作用效果明显优于单纯温针灸与单纯BMSCs,肯定协同增效作用。2.温针灸联合BMSCs移植治疗兔KOA的机理可能是通过降低Bax、Caspase-3表达,上调Bcl-2水平,抑制软骨细胞凋亡,从而发挥治疗KOA的作用。
【图文】：

BMSCs换液

拧开瓶盖，瓶口过火，用巴氏吸管将瓶内的完全培养基吸出，弃至废液缸中，取新的巴氏吸管向瓶内加入 3mLPBS，洗去残留的旧培养基，然后向瓶中加入 1mL 经 37℃预热的胰酶，显微镜下观察当细胞回缩为圆形时，敲击瓶壁，促使贴壁细胞脱落，然后向其中加入 3mL 完全培养基终止消化，吹打细胞使其完全脱壁后，将细胞悬液转移至15mL 离心管中，1000r/min×3min 离心，取出置于超净台中，弃上清，向离心管中加入3mL 完全培养基吹打重悬，将悬液分为三份转移至 3 个已盛有 4mL 完全培养基的 T25培养瓶中，瓶口过火后拧紧瓶盖，十字法摇匀，将培养瓶放入培养箱继续培养。2.3.4 BMSCs 悬液的配制:将 0.9% NaCl 溶液、胰酶、完全培养基预热至 37℃，取体外培养的第 3 代 BMSCs 经胰酶消化，倒置显微镜下观察，当细胞回缩为圆形时，敲击培养瓶壁，使细胞脱落，加入含血清的完全培养基终止消化，收集细胞悬液置于 15mL 离心管中，，1000r/min×3min 离心，弃上清，加入生理盐水吹打重悬，调整细胞浓度为1×106/mL，分装于 1mL 注射器中备用。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245

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本文编号：2626722