“通督启神”法电针对AD小鼠海马区小胶质细胞及TLR4通路的影响

发布时间：2020-05-06 10:58

【摘要】：1目的和意义阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病,对当今老龄化社会人类健康产生了巨大的威胁,给社会带来了沉重的经济负担。AD主要由淀粉样蛋白β(Aβ)沉积,异常的Tau蛋白磷酸化和脑内神经免疫炎性反应等原因引起。大量研究显示,在传统中医理论指导下,电针疗法在改善阿尔茨海默病患者临床症状和在AD模型动物实验研究中均显现出一定的优势,本研究采用“通督启神”法指导下的不同电针(脉冲电针和音乐电针)以及不同电针结合多奈哌齐对7月龄APPswe/PS1δE9转基因小鼠进行干预,旨在探讨其对于AD模型小鼠的行为学作用差异,并从小胶质细胞活化以及TLR4通路角度探讨其发挥作用的可能机制。2研究方法7月龄APPswe/PS1δE9小鼠60只随机分为6组,每组10只,分别为:AD模型组(M组)、药物组(D组)、脉冲电针组(DZ组)、脉冲电针合药物组(DZ+D组)、音乐电针组(YZ组)及音乐电针合药物组(YZ+D组)。以7月龄相同遗传背景的雄性C57BL6小鼠10只为正常对照组(N组)。N组:其他组干预时抓取一次,固定于自制鼠套,不做其他处理,1次/天;M组:同N组;D组:多奈哌齐溶液按体重以0.92 mg/kg标准灌胃,然后固定于自制鼠套,1次/天;DZ组:将小鼠固定于自制鼠套,选取小鼠百会穴(GV20)、印堂穴(GV29)、水沟穴(GV26),其中百会向上、印堂穴向下平刺进针,进针深度为0.3 cm,脉冲电针正极连接百会穴处针柄,负极连接印堂处针柄,选择疏密波,电流强度0.1 mA,频率2/50 Hz,脉冲电针干预结束,取无菌针灸针快速点刺小鼠水沟穴,不留针不连接电针;DZ+D组:每天行脉冲电针干预,方法同DZ组,灌胃给药方法同D组,连续15天;YZ组:取穴、针刺方法同DZ组,将音乐电针两级连接小鼠百会、印堂穴处针柄,选择“痴呆”音乐治疗处方,强度以小鼠头部轻轻颤动为标准;YZ+D组:每天行音乐电针干预,方法同YZ组,灌胃给药方法同D组。以上干预,20min/次,1次/天,共计15天。15天干预结束后,将各组小鼠放于Morris水迷宫恒温游泳池中进行可视平台实验,随后开始进行为期5天的隐蔽平台实验和在隐蔽平台实验,结束后24小时内进行的定位航行实验。采用HE染色方法观察各组小鼠海马区齿状回组织结构和病理变化;利用免疫组织化学法标记海马区小胶质细胞表面受体Iba1观察小胶质细胞活化数量;采用免疫荧光双标技术,观察活化小胶质细胞表面蛋白CD11b和TLR4受体表达情况;运用免疫组织化学、Western blot(WB)和RT-PCR技术观察并分析各组小鼠海马区活化小胶质细胞关键通路中TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、TAK1、NF-κB、iNOS和CD40的蛋白、mRNA相对表达情况。3研究结果3.1Morris水迷宫实验结果:可视平台实验:各组小鼠逃避潜伏期和游泳速度均无明显差异(p0.05);隐蔽平台实验;不同干预方式对各组小鼠的逃避潜伏期长短随时间变化而变化(p0.05),第2-5天,M组逃避潜伏期高于N组(p(day 2-5)0.05);与M组相比,D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组的逃避潜伏期缩短(均为p0.05),差异具有统计学意义。空间探索实验:各组小鼠穿越平台次数和目标象限(WS)停滞的时间占总游泳时间百分比(目标象限时间比)之间存在差异(均为p0.05,),具有统计学意义;M组的平台穿越次数和目标象限时间显著低于N组(p0.01);与M组相比,D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组的平台交叉数(均为p0.05)和目标象限时间比增加(p0.01),有统计学意义;与D组相比,YZ+D组在目标象限停滞的时间增多,差异有统计学意义(p0.05)。3.2各组小鼠海马区齿状回组织形态、活化小胶质细胞数量苏木精-伊红(HE)染色后(图1),N组神经元层次清晰,结构排列致密,神经元形态大小正常,核仁清晰,核仁可见,细胞簇边界清晰,胞浆呈淡红色。M组的组织病理学形态与N组相比有明显变化,神经元细胞核固缩、核移位,细胞质和细胞核的边界不明显,神经元和神经胶质细胞之间的细胞空间扩大,而海马锥体神经元变小组织结构松散,神经、胶质细胞肿胀,出现广泛的空泡变化,细胞排列紊乱;治疗后,D组、DZ组、YZ组、DZ+D组和YZ+D组的病理变化有均所改善。免疫组化标记小胶质细胞表面受体(Iba1)结果显示,N组小鼠海马中Iba1标记的小胶质细胞数量较低,观察到的小胶质细胞似乎处于静止状态,细胞体较小,染色较浅,突起细长,M组小胶质细胞呈典型的激活状态,细胞体增大,细胞突起缩短,细胞形态呈圆形或阿米巴状,Iba1阳性细胞在老年斑块周围聚集。各组小鼠海马区活化小胶质细胞数量有显著差异(p0.01);M组Iba1阳性细胞数也高于N组(p0.01);相比之下,D组、DZ组、YZ组、DZ+D组和YZ+D组的小胶质细胞多处于静止状态,活化的小胶质细胞数量均低于M组(p均0.01);其中与D组比,DZ组(p0.05)、YZ组(p0.01)、DZ+D组(p0.05)和YZ+D组(p0.01)活化的小胶质细胞数量较少;另外,DZ组、YZ组、DZ+D组和YZ+D组活化小胶质细胞数量虽有差异,但无统计学意义。3.3各组小鼠TLR4通路相关蛋白、基因的表达水平利用激光共聚焦显微镜观察各组CD11b与TLR4免疫荧光表达情况,结果显示,与N组相比,M组有着较强的CD11b与TLR4荧光表达;D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组CD11b与TLR4荧光共表达减弱。免疫组织化学结果显示,与N组相比,7月龄APPswe/PS1δE9转基因小鼠脑内海马区TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、TAK1、NF-κB、iNOS和CD40阳性细胞呈深棕色,数量较多,着色较深,且M组各指标积分光密度值显著高于N组(p0.01);经过15天干预后,与M组相比,D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组各蛋白阳性表达积分光密度值均有不同程度下降(p0.01或p0.05);其中与D组相比,YZ+D组TLR4和CD40蛋白阳性表达积分光密度值显著降低(p0.05)。WB和RT-PCR结果显示,M组海马区TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、TAK1、NF-κB、iNOS和CD40的蛋白和mRNA相对表达量均显著高于N组(p0.01或p0.05),较之M组,D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组各指标蛋白、mRNA相对表达量均有不同程度的降低(p0.01或p0.05);与D组相比,DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组各指标蛋白、mRNA相对表达量也均有不同程度的降低(p0.01或p0.05);其中,以YZ+D组下降程度最为显著。4结论(1)基于“通督启神”法的各干预措施对于7月龄APPswe/PS1δE9小鼠的空间学习能力和记忆保持能力均有一定改善,且效果优于单纯使用盐酸多奈哌齐:其中音乐电针合多奈哌齐效果最为显著;(2)7月龄APPswe/PS1δE9小鼠大脑海马区神经元数目减少,活化的小胶质细胞增多,基于“通督启神”法的各干预措施能够减少海马区活化小胶质细胞的数量,改善海马区神经元形态,减少神经细胞的坏死,可能是改善AD模型小鼠学习认知障碍的机制;(3)基于“通督启神”法的各干预措施能够减少小胶质细胞与其TLR4模式识别受体的共表达,还能够对TLR4及其信号通路下游蛋白MyD88、IRAK4、TAK1、TRAF6和NF-κB,氧化应激产物iNOS和共刺激分子CD40具有显著负调节作用,可能是“通督启神”法抑制小胶质细胞活化,减缓神经元凋亡,从而发挥改善AD小鼠学习记忆能力的可能机制。(4)基于“通督启神”法的各干预措施能够减少TLR4及其信号通路下游蛋白MyD88、IRAK4、TAK1、TRAF6和NF-κB,氧化应激产物iNOS和共刺激分子CD40的基因表达,从遗传学角度解释了其发挥改善AD样症状作用的可能机制。(5)在改善7月龄APPswe/PS1δE9小鼠学习记忆能力、保护其大脑海马区神经元、减少活化的小胶质细胞数量、降低TLR4通路相关蛋白和炎性因子表达方面,不同电针与阳性药物多奈哌齐结合使用所产生的加载效应,优于单纯使用单一的药物、脉冲电针和音乐电针。
【图文】：

由表15、图22所示,由各组小鼠海马区中CD40蛋白表达积分光密度值(IOD)结果可见,F=15.438,p<0.01,说明各组小鼠海马区中CD40的IOD值存在差异;其中,与N组相比,M组CD40的IOD值较高(p<0.05);与M组相比,D组(p=0.011<0.05)、DZ组(p<0.01)、DZ+D组(p<0.01)、YZ组(p<0.01)和YZ+D组(p<0.01)小鼠大脑海马区CD40的IOD值均有降低,差异有统计学意义;与D组相比,YZ+D组CD40积分光密度值降低(p=0.27<0.05),差异有统计学意义;DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组两两相比后并无统计学差异。由表16、图23中Western blot结果所示,各组小鼠脑内海马区CD40蛋白相对表达水平有差别[F=41.423,p<0.001]。经两两比较得出,与N组相比,M组海马中CD40蛋白相对表达量显著升高(p<0.01);与M组相比,D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组小鼠大脑海马区CD40蛋白相对表达量均有显著降低(p<0.01)。

由表16、图23中Western blot结果所示,各组小鼠脑内海马区CD40蛋白相对表达水平有差别[F=41.423,p<0.001]。经两两比较得出,与N组相比,M组海马中CD40蛋白相对表达量显著升高(p<0.01);与M组相比,D组、DZ组、DZ+D组、YZ组和YZ+D组小鼠大脑海马区CD40蛋白相对表达量均有显著降低(p<0.01)。3 讨论
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245

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