【摘要】：目的干眼是临床常见的眼表疾病,神经调节的异常是引起干眼发病的重要原因。本研究为探讨实验兔泪液分泌反射中枢在脑的分布,以及针刺对干眼模型兔泪液分泌中枢胆碱能神经元活动表达的影响,探讨针刺调节干眼模型兔泪腺中胆碱能受体介导的信号转导通路,从而促进泪液分泌的作用机制。方法(1)健康成年新西兰兔随机分为3组,用已消毒干棉棒蘸取适量薄荷樟脑混合液擦拭兔双眼下眼睑作为模型组,并设置了生理盐水组和完全空白组作为对照。2h后处死各组动物,应用免疫荧光组织化学染色法结合计算机图像分析系统,观察各组动物额叶、海马、下丘脑、脑桥和延髓神经元内c-fos蛋白的表达情况。(2)在新西兰兔泪腺注射微量伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),采用免疫荧光组织化学方法,观察实验兔存活30h、38h、46h后荧光标记神经元在脑中的分布。(3)新西兰兔随机分为正常组、模型组、西药组和针刺组4组,每组4只。正常组不做任何处理;模型组皮下注射氢溴酸东莨菪碱,2.0mg/次,4次/天,直至实验结束;西药组和针刺组从干眼动物模型制作成功开始,分别滴1%毛果芸香碱滴眼液和针刺治疗,连续治疗7天。采用Schirmer试纸检测各组实验兔不同时间段泪液分泌量,采用免疫荧光组织化学方法,观察各组实验兔各脑区神经元中胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)表达的变化。(4)将24只新西兰兔随机分为4组,正常组,模型组,西药组,针刺组,每组6只,每组处理方法同上。针刺第1,4,7,14天作眼部泪液分泌检查。针刺后第7天,第14天分别处死各组实验兔一半,采用Real-time PCR检测泪腺中M3AChR、PLCβ、PKC、Ip3、PLD1、Ras、Raf、MEK、MAPK及PyK2 mRNA表达情况。结果(1)模型组可见大量的c-fos免疫阳性细胞,生理盐水组可见少量的c-fos免疫阳性细胞,且两组动物各脑区c-fos免疫阳性细胞表达个数均值具有显著差异性(p0.05);完全空白组偶见极少量的c-fos免疫阳性细胞,且其与模型组相比,各脑区c-fos免疫阳性细胞表达个数均值具有显著差异性(p0.05),其与生理盐水组相比,额叶、海马和脑桥c-fos免疫阳性细胞表达个数均值具有显著性差异(p0.05),而下丘脑和延髓其个数均值无显著性差异(p0.05)。(2)PRV注射到泪腺30h后,仅在脑桥上泌涎核出现阳性标记神经元,存活38h后,PRV跨突触感染的第二级神经元可见上橄榄核群的上橄榄外侧核(lateral nucleus of superior olive,LSO)和上橄榄内侧核(medial nucleus of superior olive,MSO),存活46h后,在脑桥斜方体核(nucleus of trapezoid body,Tz)也出现阳性细胞,且上橄榄外侧核和上橄榄内侧核的阳性细胞更为密集,下丘脑的室旁核(hypothalamic paraventricular,PVN)也出现阳性细胞。(3)Schirmer试纸检测泪流量结果显示,在实验第28天即治疗7天后,针刺组与西药组与实验第21天相比,泪流量明显增加;实验第28天,针刺组与西药组分别与模型组比较,差异具有显著性(p0.05)。ChAT免疫阳性神经元表达与分布显示,ChAT免疫反应阳性产物较多位于脑桥的被盖背侧核和臂旁外侧核内。其阳性物质计数显示,西药组、针刺组分别与模型组比较,被盖背侧核和臂旁外侧核中ChAT免疫阳性神经元表达个数均增多,且均值具有显著差异性(p0.05)。(4)PCR结果示,在针刺第14天,和空白组相比,模型组泪腺中M3AChR的mRNA转录水平显著降低,差异具有显著性(p0.05);和模型组相比,针刺组、西药组泪腺中M3AChR的mRNA转录水平显著升高,差异具有显著性(p0.05);和空白组相比,模型组泪腺中PLD1、MAPK、Ras的mRNA转录水平显著升高,差异具有显著性(p0.05);和模型组相比,针刺组、西药组泪腺中PLD1、MAPK、Ras的mRNA转录水平显著下降,差异具有显著性(p0.05)。结论(1)针刺信息上传至干眼模型兔泪液分泌反射中枢,再兴奋其内的胆碱能神经元,使其支配泪腺的神经末梢释放ACh,促进泪液分泌。(2)针刺能引起干眼模型兔泪腺中乙酰胆碱M受体及其介导的信号转导途径中关键基因活性变化,促进泪液分泌。
【图文】：
蘸取液体量和擦拭强度均和生理盐水组相同。逡逑各组实验兔经以上分组处理，，时间间隔２小时后１｜５７＿１５８１，进行灌注固定，取脑组织切逡逑片（见图１）。逡逑１６逡逑
１．邋２．邋３组织切片逡逑脑组织沉底后取出，切取视交叉后２ｍｍ和６１１１１１１［１５９］处做海马和视丘区域冠状切片（见逡逑图４），切取脑桥部位，额叶部位，经ＯＣＴ冷冻切片包埋剂包埋后，冰冻切片机－２０°Ｃ连逡逑续切片，片厚约３０ｕｍ，隔两片取一片（见图５），收集于ｐＨ邋＝邋７．４，邋Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ中，逡逑进行免疫荧光组织化学反应。逡逑ｒｒｊｋ逡逑／ｆ邋＾逡逑图４海马和视丘区域冠状切片逦图５冰冻切片机切片逡逑１．２．邋４免疫荧光组织化学反应逡逑取各组脑组织切片按照如下操作流程进行免疫荧光组织化学反应实验（见图６），详细逡逑实验步骤参考课题组文献。逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245
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本文编号：2658523
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