电针干预GDNF、HIF-1α基因修饰NSCs移植对大鼠SCI后β-catenin及GFAP的影响

发布时间：2020-05-31 18:20

【摘要】：目的:本课题旨在使GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植电针疗法应用于脊髓损伤模型,通过对脊髓损伤大鼠行为学评价、损伤组织中β-catenin、GFAP含量的影响,评价该疗法对脊髓损伤的治疗作用,为GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植电针疗法在临床中进一步应用提供理论依据。方法:实验选用48只成年SD大鼠在相同条件下适应性喂养1周,随机分为4组:正常组(A组)12只,不给予特殊处理。将剩余的36只SD大鼠分成:损伤组(B组),GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞组(C组),电针加GDNF、HIF-1α基因修饰的神经干细胞组(D组)。采用脊髓损伤打击装置制作SD大鼠损伤模型,致B组、C组、D组的T_(12)脊髓受损。造模成功后,损伤组(B组)给予局部注射10u1 0.9%NaCl注射液;GDNF、HIF-1α修饰的神经干细胞组(C组)给予局部注射10ul双基因修饰的神经干细胞液;GDNF、HIF-1α修饰的神经干细胞加电针组(D组)给予局部注射10u1神经干细胞液,采用双侧心俞、肺俞行电针治疗;分别于移植后4个时间窗(3d、1W、2W、3W)对大鼠进行BBB后肢评分,灌注固定后取损伤段脊髓行HE染色、免疫组化染色、Western Blot等方法,通过检测移植处神经干细胞β-catenin、GFAP含量水平的变化,观察GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植电针疗法对脊髓损伤的治疗效果。结果:1.神经干细胞鉴定:细胞悬浮生长,形状较圆,彼此黏附,并且传代的细胞是球形分布的。病毒转染后,24h细胞呈对称分裂;48h细胞生长旺盛,出现多个细胞形成的个别细胞球;72h细胞分裂多,生长旺盛,形成更多细胞团。2.BBB评分:1周时C组、D组的治疗效果相似,2周后D组治疗效果优于C组。3.HE染色:脊髓损伤初期细胞排列稀疏,结构紊乱,细胞内点状出血,形成明显空洞。治疗后,神经细胞内局部出血减少,组织空洞相对变小,细胞排列紧密,破坏减轻,神经纤维渐恢复。4.免疫组化染色:GFAP阳性表达为黄棕色或棕褐色,位于胞质中且形状不规则。GFAP在脊髓损伤后,随着治疗进展,C组在2周后GFAP表达开始下降,D组在3天后GFAP表达即开始下降,3周后,D组GFAP表达低于C组,说明电针治疗可抑制GFAP表达。5.Western Blot检测:脊髓损伤后β-catenin的表达先上升后下降,3天内逐渐增加,1W后逐渐降低(P0.05),且D组的β-catenin明显高于A、B、C组,说明电针治疗能促进β-catenin表达。结论:GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植配合电针可通过促进β-catenin表达、抑制GFAP表达而治疗脊髓损伤。
【图文】：

⑨混匀增强液与稳定的过氧化物酶溶液，加于 PVDF 膜上，待荧光带明显后，用滤纸去除多余底物液，盖上保鲜膜，X 光片。3 统计学实验数据采用 SPSS22.0 统计软件分析，治疗前后各组之间采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，为差异有统计学意义：P＞0.05 为差异无统计学意义。4 结果4.1 神经干细胞的鉴定结果从 SD 新生大鼠大脑内分离提取出神经干细胞，记录细胞形态，神经干细胞呈现悬浮生长，Nestin 免疫荧光染色可以看到蓝色荧光和红色荧光，即细胞 Nestin 表达呈阳性，证明所提取的细胞为新生大鼠的神经干细胞（图 1-1）；病毒转染后，，进行荧光显微镜拍照，镜下显示绿色荧光证明成功转染 GDNF 基因，镜下显示红色荧光证明成功转染 HIF-1α基因。转染 24h 显示，细胞呈对称分裂，形成两个大小形态基本相等的细胞（图 1-2）；转染 48h 荧光显微拍照显示，细胞生长旺盛，出现多个细胞形成的个别细胞球（图 1-3）；转染 72h 荧光显微拍照显示，细胞分裂多，生长旺盛，细胞球团形成较多（图 1-4）。

图 1-2 转染 24h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)荧光标记的神经干细胞（200×图 1-3 转染 48h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)荧光标记的神经干细胞（200×图 1-4 转染 72h 含 GDNF(Green)、HIF-1α(Cherry)荧光标记的神经干细胞（200×4.2 BBB 评分结果
【学位授予单位】：陕西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R245.97

【参考文献】

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本文编号：2690268