电喷雾萃取电离质谱法快速筛查妇科恶性生殖道肿瘤的研究,妇产科及儿科论文

第 1 章   引言

近年来女性生殖道恶性肿瘤的发病率明显升高，成为影响人类生活质量水平的巨大问题。宫颈癌（Cervical Cancer  ，CC）是当前妇科恶性肿瘤发病率排行第一的疾病，因其癌细胞发展迅速和极易复发的特征，是全球癌症第六大死亡相关因素[1]。它早期筛查的手段主要是通过薄层液基细胞学（Thinprep cytologic test  ，TCT）和人乳头瘤病毒(Human  papilloma  viruses  ，HPV)检测，进而针对高危险的人群进行电子阴道镜检查及组织活检，最后做出诊断[2]。统计发现，TCT的临床阳性预测值较高，但耗时长，且需要有经验的细胞病理学家读片，而单独 HPV 检测缺乏诊断特异性。子宫内膜癌（Endometrial carcinoma，EC）是在我国发病率仅次于子宫颈癌，在欧美等发达国家女性生殖道恶性肿瘤发病率排行第一的疾病[3]。它的临床表现主要表现为绝经后阴道出血。绝大多数患者在出现临床症状后来院就诊，通过诊断性刮宫及病理活检可以确诊，经过手术及（或）放化疗手段可以达到 75%~83%的五年存活率。但仍有部分患者因就诊晚、病灶小漏刮或特殊病理类型等因素，预后差，复发率高。因此，寻找一种快速、简便、准确、敏感度高的早期筛查妇科恶性肿瘤的手段具有迫切性和必要性。
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第 2 章   材料与方法

2.1  实验材料
癌症病例入选标准：选取南昌大学第二附属医院、江西省妇幼保健院、江西省肿瘤医院、南昌大学第一附属医院 2013 年1月至2013年10 月来院诊治的宫颈癌、子宫内膜癌患者共 70例。所有患者入院时未并发其他肿瘤，取材前未行放化疗、手术等治疗，无免疫及代谢性疾病。术后病理诊断与术前一致。 对照组病例入选标准：选取南昌大学第二附属医院 2013 年 1 月至 2013 年10 月来院常规体检中正常生育期的妇女 70 例。排除妇科恶性肿瘤、肺部肿瘤、消化道肿瘤、慢性肾衰竭等。月经周期规律。 详细记录两组患者的年龄及诊断等基本信息，检查时间均选择在非月经期。取材前 3 天无性交史，无阴道用药或阴道冲洗。常规进行外阴消毒，利用窥阴器扩张阴道,暴露宫颈、阴道后弯窿，将特制灭菌棉拭子放置在宫颈管处，刮取少许阴道分泌物放置于 1.5 mL 规格的 EP 管中。所有标本采集完毕，冻存于－80℃超低温冰箱。医院伦理委员通过并准许了本研究方案，患者均签订了知情同意书。

2.2  实验方法
设置 LTQ-MS 检测模式为正离子模式，扫描检测的范围是 m/z 50~2000；电离电压为 3.5 kV；离子传输管的温度为 150 ℃；ESI  溶剂为甲醇/水/醋酸溶液（45:45:10, v:v:v）；雾化气为氮气（纯度 99.999%），压力为1.0 MPa；ESI  溶剂和样本溶液流速均为 5 μL/min； EESI  商用离子源的两个毛细管喷雾口到质谱进样口的间距b为 5 mm；两个毛细管喷雾口的间距 a为5 mm；两个毛细管喷雾间的夹角、样品毛细管喷雾口与质谱进样口间的角度分别为 60°和150°（如图1 所示）；透镜电压为  80.0 V；毛细管电压为 7 V；其余参数均由 LTQ-MS  软件系统自动优化所得。

第3章  结果 ............... 7
3.1  样品溶剂的选择和初级 ESI 溶剂优化 ..................... 7
3.2 阴道分泌物的 EESI-MS 指纹谱图 .......................... 7
3.3  不同病种的阴道分泌物的主成分分析 ................ 8
第4章  讨论 ................... 17
4.1 EESI 技术的原理及特点 .................... 18
4.2 EESI-MS 在生物医学的应用 ...................... 21
4.3 EESI-MS 在妇科恶性肿瘤的应用 .....................22
4.4  结语与展望 ...............22
第5章  结论 .................24

第 4 章   讨论

4.1 EESI 技术的原理及特点
总结得出，与传统质谱技术相比,电喷雾萃取电离质谱具有许多独特的特点：（1）EESI可以在三维空间完成离子化，能够在较长时间、较大空间上对复杂基质样品进行分散，其稳定性、灵敏度都更高。（2）EESI 可以直接实时在线快速的进行质谱检测，无需对待检样本进行繁琐的预处理，省时省力，适合临床病情瞬息万变的检测要求；（3）EESI 待测的样品无需和高压直接接触，是温和的软电离，非常适合检测蛋白类物质等；（4）EESI 的适用范围广，能够承受各种形态、性质的复杂基质，并可以有效保持它们的原生态；（5）电喷雾通道和样品进入通道的设计使得待测物本体避免了与萃取溶剂的污染或者物理损害等；（5）EESI-MS 能够较为简易的进行选择性分子-离子、离子-离子反应的研究；（6）EESI离子源的兼容性好，可以结合多种技术或者仪器进行分析检测，满足临床上床旁检测的需求；（7）检测速度快，可以达到高通量的检测要求；（8）待测样品即使< 0.05 mL  液体样品也可以获得分析数据，检测所需的量很小；（9）萃取的溶剂量小，制作简单，费时、费材少；（10）可以准确的区分不同样品的离子，准确性高；（11）EESI-MS 检测相较于 TOF-MS 等更为廉价，有望普及检测。

4.2 EESI-MS 在生物医学的应用
另外，Jackson 等[49]通过 EESI 在细菌中检测到了靶向代谢物，如 α-酮戊二酸及 6-磷酸葡萄糖酸等。Chen 等[50]采用基于EESI-TOF-MS 的方法对人体所呼出的气体进行质谱分析，成功在其中检测到许多与人体生命活动相关的代谢物。他还利用 ND-EESI-MS 对人体不同部位的皮肤进行检测，成功通过不同信号强度的代谢产物来解读人体代谢的过程[44]。Ding等[51]根据志愿者抽烟前、后的呼出气体 EESI-MS 指纹图谱研究了人体内尼古丁的代谢情况，并证明了 EESI-MS 在处理复杂样品时具备了高灵敏性，高特异性和高通量的特点，特别是对于体内代谢组学研究的半定量分析。
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第 5 章   结论

1、采用 EESI-MS 技术，，在无需复杂样品预处理的条件下，成功获取不同阴道分泌物的指纹谱图。
2、EESI 成功电离复杂基质的阴道分泌物样品，并成功获取可靠的指纹谱图数据。
3、结合 PCA 方法成功实现了对宫颈癌、子宫内膜癌患者和妇科良性疾病患者阴道分泌物进行有效快速地区分。

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参考文献（略）