大鼠脑毁损后血浆ET-1的容量变化及毁损时间的关系

前 言

损伤时间推断是根据人体形态学及别的检测技术对损伤产生的时间进行分析推断的过程，是法医学工作的重要内容，目的是为了区分尸体上的损伤为生前损伤还是死后损伤及伤后存活时间的推断，为划定嫌疑人的活动或意图提供线索，有益于案件的重建[1]。随着经济、社会、及交通等各方面的发展，脑损伤的发生率呈不断上升趋势，脑损伤是最为常见的暴力机械性损伤，大量文献报道脑损伤死亡率高达23.4%～44.7%[2-3]。 所以，脑损伤也成为国内外法医病理学研究的主要死因之一。以往脑损伤时间的推断是以损伤后脑组织常规病理学形态改变为依据的[4-6]，随着医学及科学技术的发展和相互渗透，法医病理学也进入了快速发展时代，已经可以充分运用免疫组织化学[7]、原位杂交和图像分析等技术[8]将脑损伤的研究发展到超微及分子水平[9].越来越多的研究显示，脑损伤一段时间内可以触发一系列的形态及生化反应，使脑组织发生迟发性损害，现已知约有2万种蛋白质基因在脑内特异性表达。随着研究的不断深化，损伤时间的推断也将更加精准。内皮素（Endothelin，简称 ET）是上世纪 80 年代由日本学者 Yanagisawa[10]等从猪主动脉内皮细胞分离出的一种活性肽，其由 21 种氨基酸构成，是迄今研究人体内最强的缩血管物质之一。研究证明，人体内存在三种 ET 基因，分别为ET-1、ET-2、ET-3，它们分别由不同的基因编码，ET-1 是唯一存在于血管内皮细胞的内皮素。ET-1 是内皮素家族中含量最多而且功能最主要的一种。
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材料和方法

1 材料
健康成年 SD 大鼠 64 只，雌雄不限，体重 250g-300g，由山西医科大学动物实验中心提供。
主要试剂
麻醉剂 10%水合氯醛
抗凝剂 10% EDTAPBS
缓冲液 武汉博士德生物工程有限公司
大鼠内皮素 1 放射免疫分析药盒
125I-ET-1 试剂盒
大鼠内皮素 1(ET-1)ELISA 试剂盒 厦门慧嘉生物科技有限公司

2 方法
参照 Feeney’s 法[11]建立大鼠脑损伤模型，大鼠称重后，以 10%水合氯醛进行腹腔麻醉，采取俯卧位固定于打击台上，将大鼠顶枕部常规消毒备皮，于正中线处将头皮切约 4cm 切口，剥离骨膜，以人字缝前 3mm，颅骨正中线旁 3mm处用骨钻钻一直径约为 5mm 的圆形骨窗，使硬脑膜充分暴露，并保持完好，自制一打击垫放入骨窗，模拟自由落体打击装置，以 50g 砝码沿导管于 40cm 高处落下打击骨窗处，观察片刻后以骨腊封闭骨窗，缝合头皮。正常组不做任何处理，对照组 SD 大鼠仅做钻孔处理，不做自由落体打击，，不致脑损伤。遂将大鼠置于室内安静、清洁的鼠笼中进行正常饲养，然后依据实验设计损伤时间点取材并将大鼠处死。损伤组大鼠受高处自由落体重物打击后，见骨窗内脑组织突起并有少量出血，出现小便失禁及肌张力增高的表现，出现一定程度的瞳孔改变，肢体抽搐及意识障碍，各种生理反射包括瞳孔对光反射、角膜反射、睫毛反射及刺痛反应消失，伤后各项反射消失超过 30 分钟内恢复认为模型制作成功。

材料和方法.............6
实验结果...............10
讨论..........................12
结论.........................14

讨 论

1 内皮素的化学结构
内皮素（ET）是由日本学者Yanagisawa在1988年首次从猪动脉内皮细胞中分离出的一种由21个氨基酸组成的血管活性肽物质，Inoue等[15]用基因Southern分析技术,明确人体内有三种ET基因分别编码ET-1、ET-2、ET-3三种异构肽，它们结构相似，氨基酸序列具有很高的同源性，都具有相同的氨基酸残基组成的疏水性C末端，链内有两个双硫键（1-15和3-11位之间）[16]。但ET-2、ET-3与ET-1相比，分别有2个和6个氨基酸不同。三种ET异构肽氨基酸序列图如（附录二图1）[17]所示。在人体内，ET-1的含量最高，ET-1主要在内皮细胞表达，ET-2在肾脏表达，而ET-3主要在神经系统和肾脏中进行表达。

2 内皮素的作用机制
ET通过与特异受体结合，激活磷脂酶C（PLC），生成三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG），随之生成四磷酸肌醇（IP4），IP3促使胞内Ca2+释放，而IP4则引起细胞膜钙通道开放，造成胞外Ca2+内流，导致胞内Ca2+超载，但与此同时，又激活蛋白激酶C（PKC），使Ca2+由胞内向胞外泵出，降低胞内Ca2+浓度，维持相对的稳态。在生理条件下，内皮素发挥着调节血管张力和微循环血流灌流[18]的作用。在化学和机械刺激下均可诱导ET的合成，ET几乎参与了机体所有的应激炎症反应，当机体受到某种应激刺激时，通过细胞因子的调节作用，导致内皮素增加[19]。ET最显著地作用是缩血管作用，另外还具有正性心肌力，刺激释放多种激素，促进血管内皮细胞，纤维原细胞的增殖作用。ET在心血管，神经，内分泌，消化，呼吸系统以及肿瘤等疾病的进程中也发挥着重要的作用[20-23]。
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结 论

1 本实验参照 Feeneys 法，成功复制了自由落体打击致脑损伤的大鼠模型。2 本实验采用两种检测方法，共同验证了脑损伤后血浆 ET-1 的显著表达，表明脑损伤可诱导血浆 ET-1 的合成，但随损伤时间的不同，ET-1 的含量表达程度不同，表明血浆 ET-1 的表达与损伤时间有一定关联性。3 有研究表明，正常人血浆 ET-1 的水平随年龄的增长而有所增高[38]，可认为是血浆 ET-1 用于法医实践中脑损伤时间推断的影响因素。4 还有研究表明，脑损伤后患者血浆内皮素水平升高，与损伤程度有关[39-41]。故 ET-1 含量作为脑损伤时间推断的指标还需结合损伤程度综合分析。血浆 ET-1 可作为日后法医损伤时间推断的一项指标，但其存在单一性和局限性，还需结合更多敏感性指标来准确推断。动物实验存在多种不可抗拒因素和样本的局限性，统计学上可能存在误差。所以与实际运用还存在着差距。总之，血浆 ET-1 用于法医学实践中，还有待进一步的探索和研究。
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参考文献（略）